大鼠疑核对内毒素炎症反应的影响及机制研究

， ， ， 天霞， ，

(山东师范大学 生命科学学院， 山东 济南 250014)

迷走神经末梢释放的乙酰胆碱(Ach)[1]与巨噬细胞烟碱型乙酰胆碱受体nAchRα7特异性结合，通过细胞内信号转导，抑制肿瘤坏死因子TNF-α和白细胞介素4(IL-4)的合成、释放[2]，并且这些特点在机体的炎症反应中还可以一起协作，发挥一定功效，减少炎症反应发生。研究[3-5]证明，内毒素(LPS)炎症大鼠的迷走传出神经纤维放电频率增加，脑干迷走复合体(DVC)中的即刻早期基因(Fos)蛋白表达有显著的统计学意义，并且胆碱能抗炎症通路中有DVC的参与。星形胶质细胞参与构成了中枢神经系统的基本骨架，活化的星形胶质细胞显示出很多功能，当机体受到生理和病理方面的刺激时，星形胶质细胞可以迅速作出反应。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是存在于中枢神经系统中星形胶质细胞的一种独立纤维结构蛋白质，是星形胶质细胞的特异性标记物。疑核(NA)与迷走神经背核(DMV)以及孤束核(NTS)作为副交感神经的初级中枢，在功能、结构上存在紧密联系，而且NA还与DMV构成副交感神经系统节前神经元，它发出的神经纤维组成了迷走传出神经纤维，由此可推测出NA参与炎症反应通路。已有研究证明，免疫调节存在单侧优势，大脑的左、右半球在各方面也存在不均衡性。左、右两侧的NA在参与炎症反应时是否也存在左侧优于右侧或者右侧优于左侧的一侧优势，目前鲜有相关文献研究。本文中通过设计注射LPS致炎症大鼠的实验，应用免疫组织化学技术、酶联免疫等实验技术，观察NA中Fos和GFAP的表达以及一些炎症细胞因子水平的变化，研究NA是否参与炎症反应。

1 实验

1.1 材料与试剂

实验动物雄性Wistar大鼠由山东大学动物实验中心购买，体质量为(300±20) g；一抗兔抗c-Fos购于圣克鲁斯生物技术(上海)公司；一抗兔抗GFAP购于北京博奥森生物技术有限公司；SP系列试剂盒、正常山羊血清购于北京中杉金桥公司；LPS购于美国Sigma公司。

1.2 动物分组

将大鼠随机分为LPS组和生理盐水对照组，其中LPS组按照剂量5 mg/kg(每千克大鼠体质量注射5 mg药物)注射LPS,每组6只，生理盐水对照组腹腔注射等量的生理盐水，每组6只。

将大鼠分成以下4组：假损毁左侧NA并注射LPS组，6只；损毁左侧NA并注射LPS组，6只；假损毁右侧NA并注射LPS组，6只；损毁右侧NA并注射LPS组，6只。

1.3 NA的定位与损毁

大鼠于实验前可以正常饮水、进食。对大鼠腹腔注射质量分数为4%的水合氯醛溶液进行麻醉处理，前囟沿正中线向后-12.60 mm、深度9.58 mm、双侧旁开2.1 mm进行NA定位，将损毁电极插入NA中，确保损毁电流的负极与大鼠的皮肤相连，正极在电极上，接通电损毁。手术后再饲养3 d，以进行下一步实验。大鼠经乙醚轻度麻醉后，腹腔注射LPS。

1.4 TNF-α及IL-4检测

血样采集步骤如下：从股动脉取1 mL血样置于离心管中，用离心机在温度为4 ℃时离心分离10～15 min，然后将血清放入温度为-20 ℃的冰箱储存，备用。

使用ELISA试剂盒检测样本， 根据TNF-α和IL-4的检测范围， 使用酶标仪测试试样以及标准样品的光密度，根据数值绘制标准曲线，然后根据标准曲线算出待测血样中TNF-α和IL-4的浓度。

1.5 组织准备

灌流、固定、取脑步骤如下：左心室插针达主动脉，用200～300 mL磷酸盐缓冲溶液(PBS)通过大鼠主动脉将脑组织血液冲洗干净。用250～300 mL质量分数为4%的多聚甲醛(PFA)溶液进行灌流、固定，然后将脑剖出，并放入盛有多聚甲醛的瓶中，在温度为4 ℃的冰箱再固定6 h，然后放入配好的质量分数为30%的蔗糖溶液中脱水，过夜。在脑沉底后用冰冻切片机进行切片，先粗切修片，再细切留片。将切好的脑片放在PBS中备用。

1.6 免疫组织化学染色

将切好的脑切片用PBS漂洗3次，每次5 min以冲掉包埋剂。然后加入质量分数为3%的过氧化氢与甲醇混合溶液，室温孵育30 min以消除内源性酶的活性；再加入封闭液，室温孵育1 h；最后加入兔抗GFAP抗体(用封闭液稀释，稀释度为1∶500)或兔抗Fos抗体(用封闭液稀释，稀释度为1∶500)，在温度为4 ℃时孵育过夜；次日拿出复温30 min，磷酸盐吐温缓冲溶液(PBST)冲洗3次，每次15 min，然后依次加入生物素标记山羊抗兔IgG和辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温下各孵育2 h；用二氨基联苯胺(DAB)显色液进行避光显色3～5 min；显色结束后，用PBS终止显色漂洗，最后将脑片贴在载玻片上，脱水(质量分数分别为75%、95%、100%的酒精)，透明(二甲苯Ⅰ、Ⅱ)，中性树胶封片。

1.7 显微镜拍照计数与统计学分析

使用显微镜观察脑干DMV和NTS中GFAP或者Fos在免疫组织化学实验中神经元表达情况；找出所观察部位，拍照。所有神经元每0.01 mm2的个数均用Image Pro-Plus 6.0 图象分析软件统计处理，采用平均数±标准误差表示，利用统计软件SPSS 18.0进行数据处理，采用双尾独立性样本t-检验比较组间均数。

2 结果与分析

2.1 大鼠血清中TNF-α和IL-4在LPS炎症中的表达

表1所示为大鼠血清中TNF-α和IL-4在LPS

炎症中的表达水平。由表可知，与对照组相比，LPS炎症时大鼠血清中细胞因子TNF-α水平显著升高(显著性检验水平P<0.05)， IL-4含量增大(P<0.01)。

表1 大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素4(IL-4)在内霉素(LPS)炎症中的表达水平

2.2 LPS炎症对大鼠NA的Fos阳性神经元和GFAP阳性星形胶质细胞数量的影响

与对照组相比， NA中Fos阳性神经元个数显著增加(P<0.05)，GFAP的表达量增加极显著(P<0.01)，见图1、表2。由此推断，在LPS炎症大鼠模型中，除了神经元参与炎症反应，星形胶质细胞也参与了炎症反应。

2.3 LPS炎症大鼠在电损毁左侧NA后血清中TNF-α和IL-4的表达

表3所示为LPS炎症大鼠在损毁左侧NA后血清TNF-α和IL-4水平的变化。由表可知，损毁左侧NA与假损毁相比，大鼠血清中抗炎因子IL-4在LPS炎症中的水平极显著增大(P<0.01)，而在促炎因子TNF-α中的水平极显著减小(P<0.01)。由此推测，在正常情况下，左侧NA可能对抗炎因子IL-4具有一定的抑制作用，而对于促炎因子起促进作用。

(a)生理盐水组NA的GFAP阳性星形胶质细胞表达,放大200倍(b)LPS组NA的GFAP阳性星形胶质细胞表达,放大200倍(c)生理盐水组NA的Fos阳性神经元表达,放大100倍(d)LPS组NA的Fos阳性神经元表达,放大100倍图1 内霉素(LPS)炎症时疑核(NA)中即刻早期基因(Fos)与胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达

表2 大鼠颖核(NA)在内霉素(LPS)炎症中即刻早期基因(Fos)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达

表3 内霉素(LPS)炎症大鼠在损毁左侧疑核(NA)后血清脑瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素4(IL-4)水平的变化

2.4 电损毁左侧NA对LPS炎症大鼠脑干Fos阳性神经元和GFAP阳性星形胶质细胞数量的影响

与假损毁左侧NA相比， 损毁左侧NA后， LPS炎症大鼠脑干中的NTS中GFAP 的表达虽有所增加，然而无统计学意义(P>0.05)，说明左侧NA对星形胶质细胞的活性没有较大影响；而Fos阳性神经元数量显著增多，阳性神经元的表达情况具有显著的统计学意义(P<0.01)，说明左侧NA对NTS中神经元的激活具有一定的相关性，甚至能够抑制NTS中某些神经元的表达；DMV中GFAP阳性星形胶质细胞和Fos阳性神经元的数量无统计学意义(P>0.05)，见表4、5和图2。

表4 内霉素(LPS)炎症大鼠在损毁左侧疑核(NA)后脑干孤束核(NTS)中即刻早期基因(Fos)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达

表5 损毁左侧疑核(NA)对内霉素(LPS)炎症大鼠脑干迷走神经背核(DMV)中即刻早期基因(Fos)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响

2.5 电损毁右侧NA对LPS炎症大鼠血清IL-4和TNF-α水平的影响

表6所示为LPS炎症大鼠在损毁右侧NA后血清TNF-α和IL-4水平的变化。由表可知，损毁右侧NA并注射LPS组与假损毁右侧NA并注射LPS组相比较，IL-4的水平是极显著增大的(P<0.01)，而血清中TNF-α水平没有显著性差别(P>0.05)，这与损毁左侧的结果有所不同，因此左、右两侧NA在炎症中的作用可能存在着一定的差异。

2.6 LPS炎症大鼠在电损毁右侧NA后脑干GFAP和Fos的表达情况

通过注射LPS观察，比较损毁右侧NA与假损毁右侧NA，发现大鼠NTS和DMV中GFAP和Fos的表达均无明显的变化，见表7、8和图3。由此推测，右侧NA对DVC中的神经元及星形胶质细胞无较大的影响。

3 讨论

NA是位于腹外延髓的迷走神经核，属于下橄榄核与三叉神经脊束核之间的特殊躯体运动核和内脏神经核。本课题组的前期研究表明，由LPS所致炎症大鼠脑干DVC发出的迷走传出神经纤维放电频率增加，兴奋性增强。同时，LPS大鼠脑干中Fos蛋白表达量显著增多，证明了DVC参与胆碱能抗炎症通路。延髓内脏带核团包括NTS、DMV和NA，NA与DVC不仅在结构和功能上具有密切联系，并且还与DMV构成了副交感神经系统的节前神经元[6-7]，由DMV发出的神经纤维构成了迷走传出神经纤维，因此推出NA参与了炎症反应。

LPS不仅可以促使巨噬细胞产生炎症细胞因子，还能介导炎症的发生。谢国旗等[8]的研究表明，在LPS诱导的小鼠肝损伤中，白介素-6和肿瘤坏死因子的含量明显增大，且与LPS呈显著的量效关系。张青等[9]研究发现，大鼠肺组织经过不同剂量的LPS致伤后， 剂量加强的促炎因子和抗炎因子的信使核糖核酸(mRNA)表达均增多。 本实验的研究结果发现， 大鼠腹腔注射LPS 3 h后血清中IL-4及TNF-α的含量也都增大， 且与对照实验比较，具有显著的统计学意义，这与文献[8]中的研究内容结论基本一致。C-Fos是一个伤害性基因以及Fos，当机体受到外周的各种物理化学性刺激时，它可以在其细胞内迅速表达，在感觉神经传导的神经通路上，多数神经元均会出现Fos蛋白的表达，一般与受刺激的程度成正比[10-11]。研究[12]证实，中枢神经系统中的星形胶质细胞在维持正常生理活动、神经免疫以及神经组织修复与再生中均发挥着重要的作用。GFAP是存在于中枢神经系统中星形胶质细胞的一种独立纤维结构蛋白质[13-14]，因此本文中用 GFAP来检测星形胶质细胞的表达，研究发现，经腹腔注射LPS以后，与对照组对比， NA与DMV中GFAP和Fos的表达均有显著的统计学意义。 由此推测，在构建的LPS炎症大鼠实验中，不仅有NA 和DMV 中的神经元参与炎症反应，星形胶质细胞也共同参与了反应。

(a)假损毁左侧NA并注射LPS组NTS与DMV中Fos阳性神经元的表达,放大100倍(b)损毁左侧NA并注射LPS组NTS与DMV中Fos阳性神经元的表达,放大100倍(c)假损毁左侧NA并注射LPS组NTS与DMV中GFAP阳性星形胶质细胞的表达,放大100倍(d)损毁左侧NA并注射LPS组NTS与DMV中GFAP阳性星形胶质细胞的表达,放大100倍图2 假损毁左侧疑核(NA)并注射内霉素(LPS)与损毁左侧NA并注射LPS组中大鼠孤束核(NTS)和迷走神经背核(DMV)即刻早期基因(Fos)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达

表6 内霉素(LPS)炎症大鼠在损毁右侧疑核(NA)后血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素4(IL-4)水平的变化

表7 损毁右侧疑核(NA)对内霉素(LPS)炎症大鼠脑干孤束核(NTS)中即刻早期基因(Fos)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响

表8 损毁右侧疑核(NA)对内霉素(LPS)炎症大鼠脑干迷走神经背核(DMV)中即刻早期基因(Fos)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响

(a)假损毁右侧NA并注射LPS组NTS与DMV中Fos阳性神经元的表达,放大100倍(b)损毁右侧NA并注射LPS组NTS与DMV中Fos阳性神经元的表达,放大100倍(c)假损毁右侧NA并注射LPS组NTS与DMV中GFAP阳性星形胶质细胞的表达,放大100倍(d)损毁右侧NA并注射LPS组NTS与DMV中GFAP阳性星形胶质细胞的表达,放大100倍图3 假损毁右侧疑核(NA)并注射内霉素(LPS)组与损毁右侧NA并注射LPS组大鼠孤束核(NTS)和迷走神经背核(DMV)中即刻早期基因(Fos)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达

大脑左、 右半球在结构、 功能、 认知活动等方面均具有功能不对称性[15]。 许多证据表明中枢神经系统可以对细胞因子的产生进行调控。 实验[16]发现， 切除左侧皮质后, LPS诱导巨噬细胞分泌白细胞介素1(IL-1)的含量减少, 与切除右侧皮层的结果相反。 已有实验证明,脑的不对称性会影响下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴, 在行为不对称中， 研究上通常将习惯用左手的称为左利者， 习惯用右手的称右利者。 有实验表明， 大鼠腹腔注射LPS模拟炎症疾病, 左利者、 右利者的大鼠某些激素有所增加， 且增加的程度与大脑的左、右不对称性有关， 例如， 皮质酮和血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)[17]。 从解剖学角度来观察大脑的海马等核团与下丘脑存在一定的联系， HPA轴会因这种联系而被刺激。 由于海马区可以调节该轴的兴奋性,因此有实验对海马中类固醇激素受体的分布进行了研究, 发现右侧海马区表达更高的盐皮质激素受体与左利鼠密切相关[18]。 本实验发现损毁左侧NA后， 其LPS炎症大鼠血清中IL-4水平是极显著增大的， 而TNF-α水平是极明显减小的， 其中， 左侧损毁组IL-4的质量浓度((70.05±10.98)ng·L-1)约是假损毁左侧组IL-4质量浓度((23.11±4.76)ng·L-1)的3倍， 假损毁左侧组TNF-α的质量浓度((131.22±12.44) ng·L-1)约是损毁左侧组TNF-α质量浓度)(70.05±8.01) ng·L-1)的1.9倍，可见左侧NA可能对IL-4和TNF-α分别具有不同的作用，一个是抑制，一个是促进。LPS炎症大鼠损毁右侧NA与假损毁右侧NA相比，TNF-α的水平没有显著变化，其中假损毁右侧组TNF-α的质量浓度为(89.98±9.89)ng·L-1，损毁右侧组TNF- α的质量浓度为(88.98±8.89) ng·L-1， 可见这与左侧变化水平不一致，但是IL-4的水平变化，损毁右侧与假损毁右侧组相比是极显著增大的，其中损毁右侧组IL-4的质量浓度((49.98±6.01)ng·L-1)约是假损毁左侧组IL-4质量浓度((23.08±2.98)ng·L-1)的2倍， 这与损毁左侧的结果是相同的。由此可知，左侧NA与右侧NA 在炎症反应中的作用可能存在一定的区别。NA与DVC不仅在结构和功能上具有密切联系，并且还与DMV构成了副交感神经系统的节前神经元。关于在炎症反应中，NA与DVC是否存在相互作用的问题，本实验在损毁左侧NA后发现， DVC、 NTS中GFAP的表达没有显著性差异(P>0.05)， 但是Fos蛋白的表达增加。 损毁右侧NA后， 大鼠脑干DVC包括NTS、 DMV中的GFAP和Fos的表达均无统计学意义(P>0.05)。 由此推测， 在炎症反应过程中， 左侧NA可能对NTS中神经元的激活起抑制作用， 而右侧NA对DVC中的神经元以及星形胶质细胞无影响。

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