酶法改性1,3-甘油二酯猪脂肪过程中脂质的分解氧化

万倪彤 王志耕 梅 林 薛秀恒

(安徽农业大学茶与食品科技学院;安徽省农产品加工工程实验室，合肥 230036)

我国猪肉消费量世界第一[1]，猪脂肪资源十分丰富。猪脂肪作为我国传统食用油脂，具有风味独特、能值高等特点，深受消费者喜爱。然而，现代营养学认为，长期大量食用动物源油脂，易导致血脂升高，引发肥胖症、脂肪肝、心血管疾病等“富贵病”，对人类的健康产生不利的影响[2-3]。因此，随着人们对健康膳食关注度的提高，猪油的餐饮消费量日渐减少，造成猪油资源的“过剩”[4]。通过现代食品技术可将猪脂肪改性为富含1,3-甘油二酯(1，3-DG)的功能性油脂，因1,3-DG具有降低血脂、控制体重等功效，可以在制作食品时作为食品添加剂或者替换一部分猪脂肪，使之同时具有猪脂的香气和1,3-DG的营养特性，并且不会改变食品的感官特性，因此为猪脂肪资源的升值利用开拓了新的领域[5-9]。

无论化学法还是酶法，改性处理对猪脂肪的理化特性均会产生一定影响。研究猪脂肪1,3-DG功能化改性制备过程中的理化性质变化规律及脂质氧化分解的变化，对评价改性技术的合理性、评估改性产品的安全性、完善制备技术具有理论和实践意义[10-12]。

本实验研究在制备1,3-DG过程中，脂肪酸的组分变化及其氧化变化，为1,3-DG猪脂肪制备技术改进和产品开发应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪油：市售；诺维信435酶(Novozyme 435)：丹麦诺维信公司；37种脂肪酸甲酯混合标品：美国sigma公司；正己烷、异丙醇、异辛烷、甲醇均为色谱纯：美国阿拉丁工业公司；氢氧化钾、硫酸氢钠、硫代硫酸钠、碘化钾、三氯甲烷、冰乙酸、TBA、1,1,3,3-四乙氧基丙烷、三氯乙酸、EDTA、丙三醇均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Lambda 35紫外分光光度计：美国Perkin Elmer公司；7890B气相色谱仪：日本安捷伦公司；HP-88气相毛细管柱(100 m×0.25 mm，0.20 μm)：日本安捷伦公司；ZD-85气浴恒温振荡器：常州国宇仪器制造有限公司；Allegra 64R型贝克曼台式高速冷冻离心机：美国贝克曼库尔特有限公司；1525系列高效液相色谱仪(配有2414示差检测器)：美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备

按“1,3-甘油二酯猪脂肪的制备方法”专利技术(201510391380.0)[13]方法，按照反应温度55 ℃，反应时间16 h，甘油：猪油=44%，加酶量为9%制取富含1,3-DG的猪脂。将制备原料置于150 mL锥形瓶中，于气浴恒温振荡器中，在55 ℃的温度条件下反应，每隔2 h取1次样品，离心取上层1,3-DG混合脂，于-24 ℃下冷藏待测。

1.3.2 HPLC法测定1,3-DG含量[14]

样品用流动相溶解，色谱柱：Luna silica C18(5 μm，250 mm×4.6 mm，Phenomenex)，色谱条件：流动相为正己烷/异丙醇/甲酸(20:3:1)，流速1 mL/min，柱温35 ℃。使用示差检测器进行检测，检测器温度35 ℃。检测结果使用面积归一化法进行定量。

1.3.3 脂肪酸组成及含量分析

参照GB/T 17376—2008《动植物油脂:脂肪酸甲酯制备》方法略作修改[15-18]，对含1,3-DG混合猪脂肪样品进行甲酯化处理。即称取样品1 200 mg(精确到0.1 mg)，置于10 mL连盖圆底离心管中，加入25 mL异辛烷振荡溶解，加入0.5 mol/L的氢氧化钾一甲醇溶液4 mL振荡摇匀，待其充分反应后，加入1 g硫酸氢钠中和，静置澄清后，取上清液过0.22 μm有机膜待测。

参照GB/T 17377—2008《动植物油脂:脂肪酸甲酯的气相色谱分析》方法略作修改[19-22]，检测样品的脂肪酸组成。色谱柱:HP-88气相毛细管柱(100 m×0.25 mm，0.20 μm)；检测器：氢火焰离子化检测器;程序升温：120 ℃保持5 min，以4 ℃/min升至230 ℃，保持10 min;进样量：1 μL；进样口温度：250 ℃；检测器温度280 ℃；分流进样，分流比30:1，99.999%氮气为载气，恒定流量2 mL/min；高纯氢气为燃烧气;空气为助燃气。以标准样品的相对保留时间定性，用峰面积归一化法定量。

1.3.4 脂肪被氧化程度分析

1.3.4.1 AV值的测定

参照GB/T 5009.37—2003《食用植物油卫生标准的分析方法》[23]方法进行测定，结果以mg KOH/g表示。酸值的计算见公式：

式中：V为消耗KOH溶液的体积/mL；c为KOH溶液浓度/mol/L；m为样品质量/g。

1.3.4.2 POV值的测定

参照GB/T 5009.37—2003《食用植物油卫生标准的分析方法》[23]，按滴定法进行测定，结果以g/100 g表示。过氧化值的计算见公式：

式中：V为用于测定的硫代硫酸钠溶液的体积/mL；V0为用于空白的硫代硫酸钠溶液的体积/mL；c为硫代硫酸钠溶液的浓度/mol/L；m为样品质量/g。

1.3.4.3 丙二醛值的测定

参照GB 5009.181—2016《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》[24]进行测定，结果以mg/100 g表示。丙二醛含量的计算见公式：

式中：c为从标准系列曲线中得到的试样溶液中丙二醛的质量浓度/μg/mL；V为试样溶液定容体积/mL；m为最终试样溶液所代表的试样质量/g；1 000为换算系数。

2 结果与分析

2.1猪脂肪酶法改性制备过程中1,3-DG含量的变化

猪脂肪在酶法改性制备1,3-DG过程中甘油三酯(Triglyceride，TG)、1,3-DG、1,2-DG、1(3)-单甘酯(monoglyceride，MG)和2-MG的含量变化参见图1。最终产品中1,3-DG的质量分数为44.63%。

图1 酶法改性制备1,3-DG过程中各脂肪分子的含量变化

由图1可知，在整个制备过程中，样品中1,3-DG的含量随着制备时间的增加而增加，相应的TG的含量则随着制备时间的增加而降低。在开始的2 h内，1,3-DG的含量直线增加，之后增幅减缓，于16 h达到最大值。相应的TG的含量在2 h呈内直线下降变化，表明在本制备体系条件下，TG转化为1,3-DG的反应速率在2 h内较高，之后显著减缓，且在制备时间内，转化量随着时间的增加不断累积，表明2～4 h是实现高效制备的工艺时间节点，这与吴克刚等[25]的研究结果相似。1,2-DG的转化在6 h后趋于平缓。样品中1(3)-MG和2-MG的含量随着制备时间的增加也略有增加，且增加的幅度大致相同。

2.2 酶法改性制备1,3-DG猪脂过程中脂肪酸变化

酶法改性制备1,3-DG猪脂肪过程中其脂肪酸组成变化参见表1。

表1 酶法改性制备1,3-DG过程中脂肪酸组成及相对含量

由表1可知，从猪脂肪中共鉴定出20种脂肪酸，用峰面积归一法求得，SFA、MUFA和PUFA分别占TFA的32.78%、40.66%和24.33%，SFA:MUFA:PUFA的比值为1.35:1.67:1。其中SFA 8种、MUFA 7种、PUFA 5种，主要为肉豆蔻酸(C14:0)1.16%，棕榈酸(C16:0)20.74%，棕榈油酸(C16:1n6)1.31%，硬脂酸(C18:0)10.25%，油酸(C18:1n9)37.62%和亚油酸(C18:2n6)22.01%。反应16 h后的1,3-DG成品中，SFA、MUFA和PUFA分别占TFA的32.73%、40.82%和24.20%。SFA:MUFA:PUFA的比值为1.35:1.69:1。其中SFA 8种、MUFA 7种、PUFA 5种，主要为肉豆蔻酸(C14:0)1.10%，棕榈酸(C16:0)20.69%，棕榈油酸(C16:1n6)1.29%，硬脂酸(C18:0)10.33%，油酸(C18:1n9)37.89%和亚油酸(C18:2n6)21.99%。结果表明，酶法改性制备1,3-DG猪脂肪过程中各脂肪酸占TFA的百分含量无显著差异(P>0.05)，且其总SFA、MUFA、PUFA的含量也较稳定。说明酶法改性制备1,3-DG猪脂的处理对猪脂中的脂肪酸组成无影响，这与Debnat等[26]、Malheiro等[27]的研究结果类似，他们发现不管用植物油还是动物油煎炸猪肋排，煎炸油脂中的脂肪酸组成和猪肋排的脂肪酸组成都没有显著的变化。

2.3 酶法改性制备1,3-DG猪脂过程中酸价的变化

酶法改性制备1,3-DG猪脂肪过程中AV值的变化见图2。由图2可知，制备过程中随着酶解的进行，猪脂肪中游离脂肪酸量不断增加，使得混合脂中的AV值呈升高变化，14 h时达到最高值11.18 mg KOH/g。但16 h时的检测数值已回落至8.72 mg KOH/g，表明在实验体系下，14 h左右是三酸甘油酯水解反应的最大区间。AV值升高变化趋势与1,3-DG含量的增长趋势大致相同。按《食用动物油脂卫生标准》中猪油AV值≤1.5 mg KOH/g之要求，制备2 h时混合脂的AV值(5.47 mg KOH/g)就已超标，表明控制AV值于安全范围内是酶法改性制备1,3-DG猪脂肪技术应用必须解决的问题。

图2 酶法改性制备1,3-DG过程中酸值、过氧化值和丙二醛值的变化

2.4酶法改性制备1,3-DG猪脂过程中过氧化值的变化

由图2可知，制备过程中样品的POV值呈下降趋势，于6 h后呈平缓波动变化，而且各检测阶段的POV值均小于《食用动物油脂卫生标准》之限定值(0.10 g/100 g)。表明，酶法改性制备1,3-DG猪脂肪技术方法，对混合脂的POV值的影响较小，该项指标在制备过程中能保持较好的稳定性。

2.5 酶法改性制备1,3-DG猪脂过程中丙二醛的变化

由图2可知，制备过程中，混合脂中的丙二醛含量均小于《食用动物油脂卫生标准》中的0.25mg/100 g安全值，表明混合脂中氧化产物的生成量在可接受范围。但不同制备阶段，混合脂中氧化产物的生成量呈不规则变化，其原因有待深入探讨。

POV值反映的是油脂氧化酸败初期所形成的极不稳定的过氧化产物量，极易分解产生醛、酮等有害物质。而丙二醛值反映的是油脂酸败产物醛、酸等化合物的形成量。结合两项指标分析可知，酶法改性制备1,3-DG猪脂过程中，脂肪的氧化变化主要是脂肪的过氧化物形成醛、酸的过程。6 h后，丙二醛含量快速下降，表明制备获得的1,3-DG混合油脂体系中油脂的氧化分解产物除醛、酮、酸外，还有进一步反应后的产物，这些物质的类型及特性尚有待进一步分析探明。

3 结论

酶法改性制备过程中，制备各阶段对脂肪酸含量占比影响不显著(P>0.05)，获得的1,3-DG猪脂肪其各脂肪酸含量及占比与原料猪脂肪间差异不显著(P>0.05)，酶法改性制备1,3-DG猪脂肪工艺过程不影响脂肪酸组分。

酶法制备1,3-DG猪脂肪的工艺过程中，反映油脂被氧化的POV、丙二醛指标均符合国家卫生标准。但酶法制备工艺导致产物的AV值升高，如何控制终产物的AV值是该工艺技术亟待改进完善的。

[1]潘耀国.中国肉类消费全景图和大趋势[J].西北农林科技大学学报,2011,11(1):1-6

PAN Y G.Chinese meat consumption panorama and trend[J].Journal of Northwest A&F University,2011,11(1):1-6

[2]郑淑容.我国居民油脂摄入现状及对健康的影响[J].中国食物与营养,2012,18(9):84-88

ZHENG S R.The present situation of oil intake and its influence on health of residents in China[J].Food and nutrition in China,2012,18(9):84-88

[3]COREY E S.Betapol structured lipid-A close match to mother’s milk for a healthy start to life[J].Wellness Foods Europes,2009(5):30-35

[4]田秀红.食用油脂的营养及安全性分析[J].食品科学,2007,28(9):612-617

TIAN X H.Nutrition and safety analysis of edible oils and fats[J].Food Science,2007,28(9):612-617

[5]乔晓萍,蔡东联.甘油二酯与代谢性疾病[J].食品科技,2007(1):224-227

QIAO X P,CAI D L.Diacylglycerol and metabolic disorders[J].Food technology,2007(1):224-227

[6]MAKI K C,DAVIDSON M H,YSUSHIMA R,et al.Consumption of diacylglycerol oil as part of a reduced-energy diet enhances Loss of body weight and fat in comparison with consumption of a triacylglycerol control oil[J].American Journal of Clinical Nutrition,2002,76(6):1230-1236

[7]MURASE T,MIZENO T,OMACHI T,et al.Dietary diacylglycerol suppresses high fat and high sucrose diet-induced body fat accumulation in C57BL/6J mice[J].Journal of Lipid Research,2001,42:372-378

[8]CHEN Y,SHOU T X,ZHANG Q Y,et al.Bioavailability of diacylglycerol microemulsion[J].Journal of Food Biochemistry,2001,37(2)

[9]HUANG T,CHEN Y,SHOU T X,et al.Safety Evaluation of Diacylglycerol Microemulsion in Rats/Mice[J].Agricultural Sciences in China,2011,10(7):1117-1124

[10]蔡秋杏,吴燕燕,李来好,等.厦门白姑鱼腌制加工过程中的脂肪酸变化分析[J].食品科学,2015,12:76-81

CAI Q X,WU Y Y,LI L H,et al.Changes in fatty acids during salting and drying of white croaker[J].Food Science,2015,12:76-81

[11]姚世勇,王斐,史闯,等.花椒籽仁油在加热过程中反式脂肪酸组成、酸值及过氧化值的变化[J].食品科学,2015,16:186-191

YAO S Y,WANG F,SHI C,et al.Changes in trans fatty acids composition,acid value and peroxide value in zanthoxylum bungeanum seed kernel oil during heating process[J].Food Science,2015,16:186-191

[12]KOTSIOU K,TASIOULA-MARGARI M.Monitoring the phenolic compounds of Greek extra-virgin olive oils during storage[J].Food Chemistry,2016,200:255-262

[13]王志耕,洪莹,梅林,等.1,3-甘油二酯猪脂肪的制备方法:中国,201510391380.0[P].2015-07-07[2016-12-21]

WANG Z G,HONG Y,MEI L,et al.Preparation method of lard-based DAG oil:China,201510391380.0[P].2015-07-07[2016-12-21]

[14]蒋羽鸽,王志耕,梅林,等.无溶剂体系甘油解法制备乳脂1,3-甘油二酯[J].食品与发酵工业,2016,07:176-180

JIANG Y G,WANG Z G,MEI L,et al.Synthesis of 1,3-diacylglycerol from milk fat bylipozymermim in solvent-free system[J].Food and Fermentation Industry,2016,07:176-180

[15]GB/T 17376—2008.动植物油脂 脂肪酸甲酯制备[S]

GB/T 17376—2008.Preparation of fatty acid methyl esters from animal and vegetable oils[S]

[16]宋凡.气相色谱法测定猪肉脂肪酸组成[J].饲料工业,2007,11:38-39

SONG F.Determination of fatty acid composition in pork by gas chromatography[J].Feed Industry,2007,11:38-39

[17]黄向荣,绪红霞,陈秀华,等.气相色谱法测定动物油脂中反式脂肪酸[J].中国实用医药,2014,6:251-252

HUANG X R,XU H X,CHEN X H,et al.Determination of trans fatty acids in animal fats by gas chromatography[J].China Practical Medicine,2014,6:251-252

[18]高宏,徐慧,贾涛,等.气相色谱法测定氢化油脂加工食品中反式脂肪酸含量[J].食品安全质量检测学报,2015,1:321-327

GAO H,XU H,JIA T,et al.Determination of the trans-fatty acids in hydrogenated fat processed foods by gas chromatography[J].Journal of Food Safety & Quality，2015,1:321-327

[19]GB/T 17377—2008.动植物油脂.脂肪酸甲酯的气相色谱分析[S]

GB/T 17377—2008.Animal and vegetable fats and oils-Determination of fatty acid methyl esters by gas chromatography[S]

[20]孙倩,王宝维.气相色谱法检测食品中反式脂肪酸的研究进展[J].农产品加工(学刊),2011,8:132-134，141

SUN Q,WANG B W.Review on the analysis of trans-fatty acid in food by GC[J].cademic Periodical of Farm Products Processing,,2011,8:132-134，141

[21]宋立华,陆小花,杜韩香,等.气相色谱检测食品中反式脂肪酸方法的研究[J].食品科学,2008,12:511-515

SONG L H,LU X H,DU H X,et al.Study on gas chromatography detection method of trans fatty acids in food[J].Food Science,2008,12:511-515

[22]熊素玉,叶丽努尔·哈木扎.气相色谱检测食品中反式脂肪酸的方法[J].轻工标准与质量,2016,5:41，43

XIONG S Y,YELINUER H.Method for the determination of trans fatty acids in foods by gas chromatography[J].Standard & Quality of Light Industry,2016,5:41，43

[23]GB/T 5009.37—2003.食用植物油卫生标准的分析方法[S]

GB/T 5009.37—2003.Method for analysis of hygienic standard of edible vegetable oil[S]

[24]GB 5009.181—2016.食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定[S]

GB 5009.181—2016.National standard for food safety determination of malondialdehyde in foods[S]

[25]吴克刚，孙敏甜，柴向华.酶法制备花生油甘油二酯的研究.粮食与油脂,2012(8):16-19

WU K G,SUN M T,CHAI X H.Research on production of diacylglycerol from peanut oil using enzymatic process[J].Cereals & Oils,2012(8):16-19

[26]DEBNATH S,RASTOGI N K,KRISHNA A G G,et al.Effect of frying cycles on physical,chemical and heat transfer quality of rice bran oil during deep-fat frying of poori:An Indian traditional fried food[J].Food and Bioproducts Processing,2012,90(2):249-256

[27]MALHEIRO R,CASAL S,LAMAS H,et al.Can tea extracts protect extra virgin olive oil from oxidation during microwave heating?[J].Food Research International,2012,48(1):148-154.