花生贮藏蛋白质亚基构成、缺失与籽粒主要品质间关系研究

张 岱 张智猛 丁 红 康 涛 宋文武 戴良香

(河北农业大学植物保护学院1，保定 071001)(山东省花生研究所2，青岛 266100)(泰安市农业科学院3，泰安 271000)

花生是中国重要的经济和油料作物，其含蛋白质24%～36%，其中90%为盐溶性蛋白[1]，盐溶性花生蛋白主要包括花生球蛋白(14S，类似于11S大豆球蛋白)、伴花生球蛋白Ⅱ(7.8S，类似于7S豌豆球蛋白)和伴花生球蛋白Ⅰ(2S)[2-3]。花生品种的蛋白质研究一直受到人们的重视，关于花生种子贮藏蛋白组成、籽仁发育过程中贮藏蛋白质组成的变化，以及不同基因型花生的球蛋白亚基组成的研究均有报道，不同品种的蛋白质组分和亚基含量存在较大差异，但由于花生基因型的差异，采用的方法和分类依据等的不同，结果不很一致[4-11]。有关花生种质间蛋白亚基缺失研究表明，不同基因型缺失的蛋白亚基略有不同，Shokraii等[12]发现部分花生品种存在36 ku亚基的缺失，杜寅[13]则发现双纪2号、粤油14号、闽花9号等25个品种35.5 ku亚基缺失，Liang等[14]发现兰娜型花生中缺失35 ku亚基，西班牙型品种缺失27 ku。由于球蛋白对于花生的营养品质和加工品质影响作用较大，利用不同花生品种研究和了解我国花生种质球蛋白的亚基组成与变异类型，对充分利用花生种质资源，提高资源利用效率有非常重要的意义。本研究在对208份花生种质资源的脂肪、粗蛋白质、可溶性糖和淀粉等营养成分进行分析的基础上，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术，分析了其贮藏蛋白亚基组成，旨在探索我国花生品种资源中主要营养成分含量变化、蛋白亚基组成以及其相互间的关系，为花生种质资源评价与鉴定提供参考，为推动优质花生蛋白资源的开发、提升花生蛋白产业整体效益提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 供试品种与材料

选用来自全国各地的花生品种或品系208份，由山东省花生研究所种质资源中期库、济宁市农业科学院、河北农业大学农学院、河南省农业科学院等提供(表1)。

实验在山东省花生研究所实验站进行，实验地土壤类型为褐土，表层土壤质地沙壤土，0～20 cm土壤肥力状况：有机质12.7 g/kg、水解N 89.3 mg/kg、速效P(P2O5)29.6 mg/kg、速效K(K2O)93.6 mg/kg。均于2012年5月8日播种，9月16日收获。小区面积为32 m2，随机排列，重复3次，穴播，行距40 cm，穴距18 cm，每穴2粒，常规田间管理。成熟后分小区收获，晾干后分别选取有代表性饱满荚果1 kg剥壳，籽仁备分析测定。

表1 供试花生品种及编号

1.2 测定指标与方法

脂肪含量的测定采用索氏法[15]，蛋白含量测定采用微量凯氏定氮法[16]，可溶性糖和淀粉含量的测定采用蒽酮比色法[15]。每份材料重复测定3次，取其平均值。

1.3蛋白组分SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析

采用BIO-RAD mini垂直板电泳槽进行SDS-PAGE分析。标准蛋白质Marker采用中低分子量样本，购自上海皓嘉科技发展有限公司。分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%。采用不连续缓冲系统，在内槽加入负极电泳缓冲液，外槽加入正极电泳缓冲液，将20 μL样品加入点样孔。开始时电压为15 V，待溴酚兰完全到达分离胶与浓缩胶界面后，25 V恒压电泳至结束。电泳后，考马斯亮蓝R-250染色液中染5 h，再在脱色液中脱色，直到背景脱干净为止。用蒸馏水浸泡，至背景无色，拍照。

1.4 缺失亚基成分分析

切取亚基缺失对应的谱带，依次进行胶内酶解(Trypsin，20 h)、抽提酶解肽段、ESI质谱、软件分析数据、鉴定蛋白质。测试分析由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所蛋白质研究分析中心进行分析。

1.4.1 毛细管高效液相色谱方法

色谱柱以95%的甲酸水溶液(0.1%)平衡后，样品由自动进样器上样到Trap柱。

0～50 min，0.1%甲酸的乙腈水溶液(乙腈为84%)线性梯度从4%到50%；50～54 min，0.1%甲酸的乙腈水溶液(乙腈为84%)线性梯度从50%到100%；54～60 min，0.1%甲酸的乙腈水溶液(乙腈为84%)维持在100%。

1.4.2 主要参数

LTQ Velos质谱仪(Thermo Finnigan,San Jose,CA)进行质谱分析。进样方式：Microspray，毛细管温度：200 ℃，检测方式：正离子，Trap柱：Zorbax 300SB-C18 peptide traps(Agilent Technologies,Wilmington,DE)，Column：0.15 mm×150 mm(RP-C18)(Column Technology Inc.)。

1.4.3 质谱数据采集

多肽和多肽碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描后采集20个碎片图谱(MS2 scan)。

1.4.4 数据分析

原始文件用BIOWORKS软件搜索相应的数据库。搜索使用Viridiplantae蛋白数据库，最后得到鉴定的蛋白质结果。

2 结果与分析

2.1 花生贮藏蛋白质SDS-PAGE谱带多样性

条带的粗细、染色的深浅度有较大差异，表明各个亚基的含量具有显著变化。图1示出48个品种的电泳谱带，可以说明花生种质资源或品种间贮藏蛋白电泳条带数量的多样性，表明花生蛋白种类和含量存在较高的多态性，品种间存在条带缺失。图1表明，各品种谱带中的条带数、各条带的染色强度与面积存在很大差异。每个品种清晰可见的条带为14～17条，平均为15条。各品种电泳谱带均出现4条着色较深、面积较大的条带，其余条带均着色较浅，面积较小，这与不同类型贮藏蛋白的含量有关，但每个品种的清晰和不清晰的条带均构成了贮藏蛋白谱带的连续性分布。花生贮藏蛋白电泳条带的多样性与品种中蛋白质的多样性有关，这可能是造成前人研究中因测试品种不同而获得不同数量电泳条带的主要原因。电泳条带多样性为改良花生蛋白质构成、培育加工专用品种创造了机遇。

注：a.自左至右依次为Mark、鲁花11、鲁花14、花育16号、花育17号、花育19号、花育20号、花育21号、花育22号、花育23号、花育24号、花育25号、花育27号；b.自左至右依次为Mark、花育28号、花育31号、花育32号、白沙1601、白花生、唐科8号、阜花10号、阜花11号、阜花13号、潍花6号、潍花8号、M5；c.自左至右依次为Mark1、Mark2、丰花5号、豫花15号、Z8、G2、H1、H3、Hx、16-8、16-9、HZ15、冀油1号、冀油2号；d.自左至右依次为豫花9号、豫花16号、海花1号、徐花5号、HLY3、HLY4、锦花5号、中花7号、粤油196、粤油35号、粤油79号、粤油26号、Mark。图1 部分花生蛋白亚基组成SDS-PAGE电泳图谱

2.2 花生蛋白质条带缺失

花生贮藏蛋白各亚基分子质量在14.4～97.4 ku之间，17条谱带相对分子质量分别为97.4、66.2、55.5、43.0、40.6、37.4、34.2、32.6、31.0、26.8、25.6、23.5、22.8、21.5、20.1、17.5和14.4 ku，仅有分子质量为66.2、40.6、37.4、34.2和22.8 ku的5条带颜色深、面积大，其含量较高。同时，不同品种花生贮藏蛋白在34.2 ku处有明显的条带缺失，在26.8、25.6 ku处或表现条带缺失或表现明显的颜色、面积和含量差异。

对供试的208份花生品种(系)和种质进行的SDS-PAGE分析结果表明，有45份材料在34.2 ku处有明显的条带缺失，占供试品种材料总数的21.65%，说明花生品种(系)和种质资源的球蛋白组份存在着丰富的遗传变异，花生品质育种中优良基因有着广阔的选择范围。

2.3 花生主要营养品质含量

表2表明，花生脂肪含量平均值为50.14 g/100 g，含量范围在39.56～58.96 g/100 g间；蛋白质含量平均值为27.6 g/100 g，含量范围为22.19～33.19g/100 g，其变异系数最小，仅为6.73；品种(系)间可溶性糖含量差异较大，平均含量为9.33 g/100 g，其最高含量为20.53 g/100 g，最低仅为6.78 g/100 g，其变异系数为13.55；淀粉含量的最大值为16.3g/100 g，其变异系数最大为46.96。

在分析的208个品种(系)中，脂肪质量分数超过55%的高油品种(系)有11个，分别为徐花5号(58.96 g/100 g)、HLY1(58.71 g/100 g)、HLY2(56.28 g/100 g)、HLY3(55.94 g/100 g)、HLY4(56.21 g/100 g)、HLY5(55.22 g/100 g)、HLN2(56.33 g/100 g)、HLL20(55.58 g/100 g)、金花1012(56.2 g/100 g)、E12(55.67 g/100 g)和远育1808(55.24 g/100 g)，其占分析样本的5.26%；高蛋白含量品种(粗蛋白质含量大于32 g/100 g)仅有3个，分别为A021(33.19 g/100 g)、550GFA-1(33.17 g/100 g)和粤油26(32.13 g/100 g)；而高于30.0 g/100 g的品种达31个；可溶性糖高于20.0 g/100 g的品种(系)为2个，分别为红皮花生和豫花15。

表2 花生籽仁主要营养成分含量/g/100 g

2.4 花生亚基缺失与品质间的相关关系

表3表明，花生籽仁蛋白质、脂肪、可溶性糖和淀粉含量各品质指标间的相关关系不同，脂肪含量与蛋白质和可溶性糖含量间均无明显相关关系外，其余品质指标间均存在显著或极显著的相关关系；且淀粉含量与蛋白质、脂肪和可溶性糖间均表现极显著的负相关关系，而可溶性糖与蛋白质、脂肪含量间均表现正相关关系，脂肪与蛋白质间表现不显著的负相关关系。其中，淀粉和可溶性糖含量间的相关性最高，相关系数最大，达-0.741 5；其次为淀粉与蛋白质含量间的相关关系，相关系数为-0.399 1；淀粉与脂肪含量间的相关系数为-0.334 8，蛋白质与可溶性糖含量间呈极显著的正相关，但其相关系数较小，为0.320。说明花生以蛋白质含量为育种目标选育品种,可能保持较高的可溶性糖和淀粉含量。而在选育高脂肪含量的花生品种时,淀粉含量极显著降低。

表3 花生品质与条带缺失间的相关关系

注：*和**分别表示相关性达1%和5%的显著水平。

花生蛋白质条带缺失与籽仁品质间的关系因指标不同而不同，除蛋白质条带缺失与淀粉含量间呈极显著的正相关关系外，其余品质指标与条带缺失间均呈负相关关系，且可溶性糖与条带缺失间的负相关关系达显著水平。花生蛋白质条带缺失的品种淀粉含量较低，条带缺失与淀粉含量间的相关系数为0.257 8，达极显著水平，其与可溶性糖含量间的相关系数为-0.139 7，条带缺失的品种可溶性淀粉含量相对较高。

2.5 缺失亚基功能分析

对所鉴定的蛋白质通过数据库检索以及相关的文献查询，共检测得到112个肽段，其中18个蛋白质为可信蛋白(表4)。18个可信蛋白中的11个蛋白质参与免疫调节过程，占可信蛋白的61%，4个蛋白参与氧化作用(22%)，1个蛋白质参与信号传递(6%)，还有2个蛋白为其他或未知功能蛋白(11%)。

表4 蛋白鉴定结果和功能分类

3 结论

脂肪和蛋白质是花生的主要营养成分，其质量分数分别为39.56～58.96 g/100 g和22.19～33.19 g/100 g，平均值分别为50.14 g/100 g和27.6 g/100 g。花生籽仁中可溶性糖和淀粉含量平均值分别为9.33 g/100 g和7.37 g/100 g，但其变异系数较大，分别为13.55和46.96。花生籽仁淀粉含量与蛋白质、脂肪和可溶性糖间均表现极显著的负相关关系，可溶性糖与蛋白质含量间呈极显著的正相关而脂肪含量与蛋白质和可溶性糖含量间均无明显相关关系。可溶性糖和淀粉含量是影响花生口感的重要因素，也是判别食用型花生主要指标，其含量高低对食用型花生品种培育与改良具有重要意义。花生以蛋白质含量为育种目标选育品种,可能保持较高的可溶性糖和淀粉含量，在选育高脂肪含量的花生品种时,淀粉含量极显著降低。

花生贮藏蛋白共有14～17条条带，各亚基分子质量在14.4～97.4 ku之间，仅有分子质量为66.2、40.6、37.4、34.2和22.8 ku的5条带颜色深、面积大，其含量较高，一些品种在34.2 ku处有明显的条带缺失，占供试品种材料总数的21.7%；在26.8、25.6 ku处或表现条带缺失或表现明显的颜色、面积和含量差异。对缺失蛋白亚基进行SHOTGUN测试，共检测得到112个肽段，其中18个蛋白质为可信蛋白，其功能涉及生物细胞代谢/能量代谢、免疫调节、信号传递等细胞过程。缺失蛋白涉及花生各个生长发育过程，可能与花生生物产量的提高和品质的改善有密切关系。因此，筛选、培育优良花生特定亚基缺失品种，深入研究花生蛋白组分及其不同亚基蛋白组的形成规律以及其营养和功能特性，可为表征花生品种的优劣、优良品种筛选、优质花生蛋白资源的开发，以及花生食品工业的发展提供参考。

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