谷氨酰胺转氨酶对小米制面性能及淀粉体外消化的影响

靳志强 白变霞 赵晋峰 陈艳彬 王 玺

(长治学院生物科学与技术系1，长治 046011)(山西省农业科学院谷子研究所2，长治 046011)

小米含有多种维生素、矿物质和植物性化学成分，被认为是一种潜在的功能食品。流行病学研究表明，胆固醇代谢失调、2型糖尿病等慢性病风险的降低与小米及其产品食用增加有相关关系[1]。由于高膳食纤维含量，小米在印度被推荐为糖尿病人的食物[2]。

小米在我国最普遍和最简单的食用方式是小米粥。面条制品是中国及其他亚洲国家人民喜欢的传统主食，将小米开发为主食面条，可以提高食用方便性。另外，面条制作过程中可以形成致密的淀粉-蛋白网络结构，阻止了消化过程中α-淀粉酶的自由进入，从而某种程度上降低了食物的GI(生糖指数)[3]，进而增强了小米食品的功能性。但是，由于小米蛋白不能形成面筋网络结构，因此仅依靠淀粉的特性，小米粉难以形成有黏弹性的面团，无法满足制面工艺的需求。对于无面筋谷物，一般可以添加谷朊粉改善面团的加工特性和终产品的质量性能，或者通过发酵、水热处理和酶处理等方式为产品的加工提供必要的网络结构[4]。其中，添加谷氨酰胺转氨酶(TGase)能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和赖氨酸的ε-氨基之间进行反应，使蛋白质间发生共价交联，从而增强蛋白的网络功能。但是，利用非小麦谷物制备的无面筋产品中，供TGase进行交联的蛋白和赖氨酸残基含量非常低。小米蛋白中赖氨酸缺乏[5]，因此制作小米面条需要进行蛋白强化。例如，大豆分离蛋白、乳清蛋白和卵清蛋白等常被用来增强TGase的蛋白交联反应，同时也可以增加无面筋产品的营养价值[6]。

作为食物中主要的碳水化合物，淀粉消化和吸收的延缓，将有益于糖尿病、肥胖、高脂血症等代谢疾病的膳食调节。除了淀粉本身的粒径分布、平均分子量、直链淀粉和支链淀粉的比率外，食品的加工工艺和配料组分都会使淀粉消化速率发生变化[7]。TGase催化同源蛋白或异源蛋白交联形成的网络结构将淀粉包裹于其中，可能会降低淀粉的代谢反应。Gan等[8]在含大豆分离蛋白的黄碱面条中添加核糖和TGase，降低了淀粉的消化速率，使生糖指数(GI)显著减小。但是，TGase处理对小米面条的淀粉体外消化的影响鲜见报道，尤其是鲜有从微观层面和分子水平上对TGase影响机理的探究。

本研究在小米粉中添加15%的谷朊粉或蛋清粉制备小米面团，通过色差仪、质构仪、蒸煮实验和体外模拟胃肠道消化体系，从宏观层面研究TGase处理对小米面团的制面性能(色泽、质构性能、蒸煮性能等)和淀粉体外消化速率的影响；并进一步用SDS-PAGE、游离氨基含量分析、扫描电镜和低场核磁共振成像仪从微观层面和分子水平上测定TGase处理引起的蛋白分子、微观形貌和水分状态等方面的改变，以解释TGase对小米面条质量性能和营养功能的影响机理，旨在为低GI小米面条的研究与开发提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 主要材料

小米：山西沁州黄小米集团；谷朊粉：瑞祥生物科技有限公司；蛋清粉：江苏康德蛋业有限公司；海藻酸钠：丹尼斯克公司；TGase：一鸣生物科技有限公司；L-亮氨酸标准品：北京索莱宝科技有限公司；α猪胰淀粉酶(A3176，sigma)、淀粉葡萄糖苷酶(A7420，sigma)：Sigma-Aldrich公司；D-葡萄糖(GOPOD格式)检测试剂盒K-GLUC：爱尔兰Megazyme公司。其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1901双光束紫外可见分光光度计：北京普析有限责任公司；TA-X2i质构仪：英国Stable Micro System公司；TM3000型台式扫描电子显微镜：日本日立公司；VFD-21S型冷冻干燥仪：美国IXRF公司；NMI20-015V-I型核磁共振食品成像分析仪：苏州(上海)纽迈电子科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 小米面条的制备

小米用万能粉碎机磨粉后，过80目筛，用于小米面条的制备。参照Wang等[6]关于燕麦面条的配方，设计小米面条配方如表1所示。25 g沸水缓慢加入50 g小米粉中混合搅拌2 min，面团静置待温度降至30 ℃后，将剩余的小米粉(35 g)、水和其他配料加入，用手混合搅拌揉制成面团[9]。和好的面团用保鲜膜包好在37 ℃培养箱静置熟化20 min后，在压面机上逐步压延成厚1 mm的面带。为便于小米面条特性的测定，将面带切成12 cm×2.0 mm(长×宽)的面条置于4 ℃冰箱内备用。

表1 小米面条配方

1.3.2 色泽测定

将制得的面带裁取10 cm×10 cm的面片，用色差计测定其色泽，记录L*、a*、b*值。

1.3.3 蒸煮性能测定

参照Jang等[10]的方法测定小米面条的蒸煮特性。

1.3.4 质构性能测定

参照陈书攀等[11]的方法，用质构仪在TPA模式下对质构性能进行测定。

1.3.5 淀粉的体外消化

煮熟的小米面条样品冷冻干燥。冻干样品磨粉，过80目筛，筛下的粉末用于体外消化过程。参照Cornejo等[12]的方法对小米面条进行体外模拟消化。葡萄糖含量用D-葡萄糖检测试剂盒K-GLUC测定。总淀粉用酶比色法测定。淀粉可消化性表示为淀粉水解率，即某时刻每100 g干淀粉中的消化淀粉(DS)，通过式(1)计算[13]。

(1)

式中：GG为葡萄糖浓度/mmol/L；V为消化液体积/mL；180为葡萄糖的相对分子质量；W为样品质量/g；S为样品中淀粉含量/g/100 g干样品；M为样品含水量/g/100 g样品；0.9为葡萄糖转变为淀粉的化学计量数。

快消化淀粉(RDS)，慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)的质量分数根据式(2)、式(3)和式(4)计算得到[13]。

(2)

(3)

RS=100%-(RDS+SDS)

(4)

式中：G20为样品体外消化20 min时水解得到的葡萄糖质量；Gf为样品中游离葡萄糖的质量；G120为样品体外消化120 min时水解得到的葡萄糖质量；0.9为葡萄糖转变为淀粉的化学计量数；TS为样品中总淀粉的质量。

1.3.6 总蛋白提取及SDS-PAGE

小米面条放入45 ℃烘箱中干燥2 h，然后磨粉，过80目筛，参照Kim等[4]的方法对小米面条中的总蛋白进行提取及电泳分析。

1.3.7 游离氨基含量的测定

参照Wang等[6]的方法测定小米面条中的游离氨基含量。

1.3.8 扫描电镜显微照相(SEM)

参照Li等[14]的方法对小米面条的横截面进行样品处理，用扫描电镜下放大1 000倍观察微观形貌。

1.3.9 核磁共振成像(MRI)

根据1.3.1所述方法制得的厚4 mm的面带用PE保鲜膜包好后置于25 ℃培养箱中，于储藏时间0、24、48 h切取2 cm×1 cm(长×宽)的面片。参照Li等[14]的方法用核磁共振食品成像分析仪进行成像(MRI)。

1.4 统计分析

数据为3次重复的均值，误差项以均方差表示。采用SPSS 19.0进行数据分析，使用Origin 8.5绘图。

2 结果与分析

2.1 TGase处理对小米面条色泽的影响

色泽是小米面条的一项重要的质量特性，消费者更希望小米面条保持黄亮的色泽，而暗灰色是消费者不喜欢看到的。4种面条的色泽分析如图1所示。不添加TGase时，含蛋清粉的面条的亮度值(L*)显著低于含谷朊粉的面条，而黄色值(b*)显著高于含谷朊粉的面条。Gan等[8]在含大豆分离蛋白的黄碱面条中添加核糖，面条黄色值升高，并将这一现象归因于核糖与蛋白发生美拉德交联引起了色泽变化。本研究中含蛋清粉的小米面条的黄色值较高则可能是由于蛋清粉在高温生产过程中发生美拉德反应从而随蛋清粉引入面条所导致的。添加TGase后，含谷朊粉或蛋清粉的小米面条的L*和b*都显著降低。Gan等[8]研究发现，TGase处理对含大豆分离蛋白的黄碱面条的色泽没有显著影响。这种差异可能与不同面条中的内源蛋白和外源蛋白不同有关。

图1 TGase对小米面条色泽的影响

2.2 TGase处理对小米面条蒸煮性能的影响

不同面条样品的吸水率和蒸煮损失等蒸煮特性见表2。面条的吸水率和蒸煮损失与面条配方有关。不添加TGase时，含谷朊粉的面条的吸水率与与含蛋清粉的面条之间没有显著差异，但含蛋清粉的面条的蒸煮损失更低，这可能归因于卵清蛋白的胶凝和海藻酸钠对淀粉颗粒的微胶囊包埋作用。

表2 小米面条的蒸煮特性和质构特性

注：数据均为平均值±标准偏差；同一列中不同字母表示在P<0.05水平有显著差异。

添加TGase后，含不同外源蛋白的小米面条的吸水率和蒸煮损失都出现了降低。尤其是含谷朊粉的面条，其吸水率从84.8%降低到72.3%，其蒸煮损失从8.6%降低到6.6%。吸水率的降低可能是由于蛋白分子间的交联形成了更为致密的网络结构，从而阻碍了蒸煮过程中水分的渗入。蒸煮损失指蒸煮过程中由面条迁移至蒸煮水中的固体物质总量，主要是由于直链淀粉溶出和一些水溶性蛋白溶解所引起[10]。添加TGase引起蒸煮损失的降低，可能是由于TGase交联作用使蛋白网络增强，淀粉颗粒包裹在蛋白网络中从而使淀粉溶出变得困难。Kim等[4]在添加大米分离蛋白和TGase的米粉中也发现了相似的结果。Wang等[6]的研究中，含谷朊粉或蛋清粉的燕麦面条的吸水率和蒸煮损失高于本研究中的小米面条，其原因可能是燕麦淀粉和小米淀粉间的差异造成的。

2.3 TGase处理对小米面条质构性能的影响

良好的面条产品应结构紧实，富有弹性，低黏性。TGase处理对含谷朊粉或蛋清粉的小米面条质构特性的影响如表2所示。与含谷朊粉的小米面条相比，含蛋清粉的面条有更高的硬度。小米面条硬度的差异主要是由于面筋蛋白和卵清蛋白不同的胶凝特性引起的。在加热过程中清蛋白浓缩形成的凝胶网络可以赋予面团坚实的质构，从而提高了蒸煮面条的硬度。经TGase处理后，含谷朊粉或蛋清粉的小米面条的硬度均出现增加，但与处理前并无显著差异。

不添加TGase时，含谷朊粉的面条(面条Ⅰ)的弹性显著高于含蛋清粉的面条(面条Ⅲ)。这是因为谷朊粉具有更好的黏弹性和延伸性。添加TGase后，含谷朊粉的面条(面条Ⅱ)弹性进一步增加；含蛋清粉的面条的弹性在TG处理前后无显著差异。

黏着性反映的是食物在咀嚼时对上腭、牙齿、舌头等接触面黏着的性质。黏聚性反映了食物在咀嚼时抵抗受损并紧密连接、使之保持完整的性质。与含谷朊粉的面条(面条Ⅰ和面条Ⅱ)相比，含蛋清粉的面条(面条Ⅲ和面条Ⅳ)有更低的黏着性和更高的黏聚性，表现出面条不黏，口感劲道。TGase处理没有表现出显著影响(P>0.05)。

2.4 TGase处理对小米面条中淀粉的体外消化的影响

图2是在体外条件下测定4种小米面条的淀粉消化动力学曲线，由图2可知，含谷朊粉的小米面条经TGase处理后，降低了淀粉消化的速率和程度，这一现象可进一步由淀粉组分分析予以证实，如表3所示。

图2 体外模拟小米面条的淀粉消化动力学曲线

含谷朊粉的小米面条添加TGase后，RDS的质量分数由57.6%降低到52.3%，同时RS的质量分数从16.0%增加到21.9%，SDS有所降低，但并不显著。该结果表明，TGase可能通过催化蛋白质的酰基转移反应，导致同源蛋白或异源蛋白之间发生交联，网状结构将淀粉颗粒截留在样品中，从而限制了底物的移动和酶的作用。某些不可消化的聚合物和一些交联的非纤维性化合物可以降低淀粉的消化速率，使代谢水平处于较低状态[[8]。

含蛋清粉的小米面条添加TGase后，淀粉消化速率的变化并不明显。尽管SDS的质量分数从31.8%显著增加到34.5%，但RDS和RS的变化并不显著。Gan等[8]将含大豆分离蛋白的黄碱面条用TGase交联处理后，生糖指数(GI)减小但并不显著。这说明TGase对面条中淀粉消化速率的影响取决于面条中所含的蛋白质，或者说与蛋白的交联程度有密切关系。

此外，不添加TGase时，含蛋清粉的小米面条(面条Ⅲ)的RDS质量分数显著低于含谷朊粉的小米面条(面条Ⅰ)，而SDS和RS质量分数显著高于含谷朊粉的小米面条。这种差异可能是由于含蛋清粉的小米面条配方中加入了海藻酸钠的缘故。研究表明，海藻酸钠除了可以改善面团的结构外，还可以抑制淀粉的消化。海藻酸钠是一种不可消化的膳食纤维，其对淀粉颗粒的微胶囊包裹可以作为淀粉颗粒和消化酶之间的物理屏障，从而降低淀粉的水解[15]。海藻酸钠的亲水性也可能限制了体系中水的可利用性，从而降低了消化酶的催化活性，延缓了淀粉的水解速率[10]。

表3 小米面条淀粉组分分析/%

2.5小米面条总蛋白的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

为了表征小米面条经TGase处理后可能出现的蛋白质交联现象，对小米面条总蛋白电泳分析。如图3所示，面条Ⅰ的主要蛋白条带出现在约17、23、39、46、59 ku处(泳道1)，面条Ⅲ的主要蛋白出现在17、23、43、59、85 ku处，其中在43 ku附近出现了一连串的蛋白条带(泳道3)。与泳道1相比，含谷朊粉的小米面条经TGase处理后(泳道2)，高分子量蛋白条带强度明显降低，如46、72～95 ku间的蛋白条带，但在约61 ku处蛋白条带宽度变大且强度增强，并发现在泳道2的凝胶顶部有大蛋白聚集(标记为A)。与泳道3相比，含蛋清粉的小米面条经TGase处理后的电泳图谱(泳道4)未发生太大变化，只是在凝胶顶端蛋白强度增强(标记为B)。结果表明，TGase可以使小米蛋白与外源蛋白发生聚合。有研究发现TGase的存在会使小麦、大豆和荞麦的蛋白条带减弱或某些蛋白条带消失，以及在分离胶顶端有蛋白的堆叠，这都表明分子间发生了蛋白交联[4]。蛋白分子间相互作用引起蛋白分子量的增加，可以改善面条的黏性、弹性和功能特性。

注：泳道M：蛋白Marker；泳道1：面条Ⅰ(小米粉+谷朊粉)泳道2：面条Ⅱ(小米粉+谷朊粉+TG)；泳道3：面条Ⅲ(小米粉+蛋清粉)；泳道4：面条Ⅳ：(小米粉+蛋清粉+TG)。图3 小米面条总蛋白SDS-PAGE电泳图谱

2.6 TGase对小米面条中游离氨基含量的影响

TGase能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和赖氨酸的ε-氨基之间进行反应，从而使蛋白质间发生共价交联。由于氨基参与交联反应，游离氨基数量减少可以表明TGase催化了该交联反应。Marcoa等[16]研究发现，谷物蛋白用TGase处理引起游离氨基数量的减少。为了评估TGase的影响程度，对添加TGase的小米面团中的游离氨基含量进行测定，结果如图4所示。添加谷朊粉的小米面条中，随着TGase添加量的增加，游离氨基含量显著降低，表明TG催化蛋白质间发生了交联反应。该交联反应可能发生在同源蛋白间，也可能发生在异源蛋白间。但是，添加蛋清粉的小米面条中，TGase低添加量(1%)引起游离氨基数量的降低，TGase高添加量(2%～3%)反而引起游离氨基数量的升高。游离氨基数量的升高可能是由于脱酰胺反应引起蛋白质溶解度的增加[16]，也可能是由于蛋清粉生产过程中的热变性和蛋白集聚一定程度上抑制了TGase对小肽链和氨基酸的结合与催化反应[17]。

图4 TGase处理对小米面条中游离氨基含量的影响

2.7 小米面条的微观形貌

由图5可以看出，添加谷朊粉的小米面条(面条Ⅰ)部分区域隐约可见纤维状面筋网络，不少淀粉颗粒裸露。经TG酶处理后(面条Ⅱ)，蛋白网络分布均匀，纤维状面筋网络更为连续和封闭，淀粉颗粒镶嵌于其中；添加蛋清粉的小米面条(面条Ⅲ)与含谷朊粉的面条(面条Ⅰ)相比，蛋白-淀粉复合结构更为致密。含蛋清粉的小米面条经TGase处理后(面条Ⅳ)，淀粉颗粒被很好的包裹在海藻酸钠和蛋白形成的网络结构中。小米面条添加TGase前后微观结构的变化进一步阐明了TGase处理能促进面团蛋白网络结构的形成，并可一定程度上解释TGase引起的蒸煮性能和质构性能的改善以及淀粉可消化性的改变。

图5 小米面条横切面的扫描电镜显微图片(SEM)

2.8 储藏期间小米面条的核磁共振成像分析

低场核磁共振及其成像技术(NMR和MRI)可以从微观上研究食品内部水分的状态、分布和迁移情况，具有快速、无损、准确的特点[18]。储藏时间的延长会影响小米面条中蛋白的网络结构以及水分的分布和迁移，为了更直观地说明面条在储藏期间内部的变化情况，取4种面条样品分别于贮藏0、24、48 h时进行MRI成像。

图6为储藏过程中MRI图像变化，其中图像较亮的区域表示质子密度信号强，水分分布均匀；图像暗的区域表示质子密度信号弱，蛋白网络结构遭到破坏，水分发生迁移。蛋白网络结构的形成有利于结合更多的水分并限制其流动性，从而可以减少微生物的生长和其他生理生化反应所需的自由水[14]。如图6所示，刚制出的4种面条(0 h)图像为均匀的亮斑，表明水分分布均匀。储藏24 h后，图像中出现了个别不规则的暗斑。储藏48 h后，不添加TGase的面条中暗斑的数量和大小显著增加，表明面片内部结构发生显著变化。而添加TGase的小米面条中的蛋白网络结构对水分束缚力更强，从而可以减缓贮藏过程中的水分迁移和微生物发酵以及面条结构的劣变。

图6 储藏过程中小米面条的核磁共振图像(MRI)

3 结论

小米面条经TGase处理后，面条的蒸煮损失降低，面条的弹性有所提高，但面条的黄色值(b*)减小。TGase处理显著降低了含谷朊粉小米面条的淀粉消化速率，使RDS的含量由57.6%降低到52.3%，而RS的含量从16.0%增加到21.9%；含蛋清粉的小米面条添加TGase酶后，淀粉消化速率的变化并不明显。SDS-PAGE和游离氨基含量分析表明，TGase可以催化含谷朊粉或蛋清粉的小米面条中的蛋白质发生交联反应。SEM显示TGase处理使淀粉颗粒被更好的包裹在网络结构中。MRI发现小米面条中添加TGase可以减缓储藏过程中的水分迁移和面条结构的劣变。

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