秀丽高原鳅胚胎发育观察

2018-03-10钟文武李光华左鹏翔王志飞张建斌缪祥军崔丽莉姜志武

水产科学 2018年1期

梁祥，钟文武，冷云，李光华，张宇，左鹏翔，王志飞，张建斌，缪祥军，崔丽莉，姜志武

( 1.云南省渔业科学研究院，云南昆明 650111； 2.云南华电鲁地拉水电有限公司，云南昆明 650228 )

秀丽高原鳅(Triplophysavenusta)属硬骨鱼纲、鲤形目、鳅科、高原鳅属鱼类，仅分布于云南省漾弓江流域干支流及附属湖泊水域(属金沙江水系)[1]，分布地域狭窄，其野生种群抵御自然和人类影响能力较弱。近年来自然干旱少雨导致有秀丽高原鳅分布的龙潭水域水位急剧下降，自然栖息地的环境变化剧烈；由于其独特的口感及风味，深受产地人们的喜爱，对野生种群的捕捞屡禁不止；而随着产地旅游经济的高速发展，对秀丽高原鳅的消费需求也急速增长，对自然种群的存续构成严重挑战，亟需开展物种保护相关工作。目前，秀丽高原鳅的有关研究仅有生物学性状与肌肉氨基酸组成[2]和肌肉营养成分与品质[3]野外栖息地水质状况[4]、野生群体种群生存力与最小可存活种群数估算[5]及其野生群体的时空分布区域[6]等研究；掌握人工繁殖及胚胎发育的时空条件是进行人工保护的重要条件，高原鳅属鱼类胚胎发育的研究目前仅见于安氏高原鳅(T.angeli)[7]、西昌高原鳅(T.xichangensis)[8]、贝氏高原鳅(T.bleekeri)[9]和叶尔羌高原鳅[T.(Hedinichthys)yarkandensis][10]。对秀丽高原鳅开展人工繁殖技术研究，在一定环境中，观察胚胎发育进程，为其人工扩繁提供技术保障，有益于物种保护研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

网箱(1 m×1 m×1 m),筛绢(40 cm×40 cm)，不锈钢圆口盆，购自宁波第二激素厂的促黄体素释放激素类似物和人绒毛膜促性腺激素，1 mL医用注射器，sartorius BSA224S-CW分析天平， Nikon SMZ800体视镜，Nikon ECLIPSE50i正置显微镜，75%医用酒精，镊子，直尺等。

1.2 试验亲本

2015年7月29日，于云南省鹤庆县草海镇新华村黑龙潭就地用地笼现场捕捞秀丽高原鳅亲本，雄鱼体长4.9～7.4 cm，体质量2.0～6.4 g；雌鱼体长6.5～10.0 cm，体质量3.6～16.4 g。雌雄性比1∶1，亲本合计200尾。雌体腹部明显膨大，弹性较好，色彩艳丽有光泽，体型较短；雄体较细长，体色较暗。

1.3 试验方法

2015年7月29日8:00，对所有采集的亲鱼采用人工背部肌肉一次注射催产素(促黄体素释放激素类似物5 μg/kg+人绒毛膜促性腺激素1000 IU/kg)，雌鱼0.2 mL，雄鱼减半，注射后将其置于龙潭的网箱中，网箱中放有筛绢，每2 h观察一次，待其产卵授精后，收集附有鱼卵的筛绢置于室内的不锈钢盆中，计数并进行人工孵化，孵化过程中，每日早晚各换一次水，新水来自黑龙潭，水温差控制在±1.0 ℃以内，于体视镜下观察受精卵的发育情况，每次观察卵粒数不少于30粒，拍照并记录发育周期，用NIS-Elements软件测定数据。出膜后，移出筛绢，待平游后以鸡蛋黄做开口饵料，进行仔鱼的人工培育。所得数据用Excel 2007处理。

2 结果与分析

通过活体解剖，卵粒成熟至Ⅴ期时，卵径为1.03 mm；卵具有黏性；在水温17.0 ℃条件下，人工催产后约24 h产卵，计数获卵1517粒，并置于室内盆中孵化，孵化水温(17.5±1.0) ℃，经约77.75 h，开始出膜，刚出膜时仔鱼全长3.66 mm，卵黄经约120 h吸收后，开始平游觅食。

2.1 胚胎发育观察

秀丽高原鳅的胚胎发育全程可划分为7个阶段：受精卵胚盘形成阶段、卵裂阶段、囊胚阶段、原肠胚阶段、神经胚形成阶段、器官形成阶段和孵化出膜阶段。胚胎发育各时期特征见表1。

表1 秀丽高原鳅胚胎发育时序

(续表1)

发育时期记录时间间隔时间/min外部特征图序眼囊出现期2015⁃07⁃318：30324眼囊形态清晰，呈椭圆形，头部可分辨出原始的前、中、后三部分，整个胚体卵径达到1．33mm。1s尾芽形成期2015⁃07⁃3113：40310胚体末端腹面与卵黄球结合部出现尾基形态。1t尾芽出现期2015⁃07⁃3114：4868胚体末端腹面与卵黄球结合部，呈圆锥状。1u尾芽游离期2015⁃07⁃3115：4153胚体末端腹面圆锥状与卵黄分球离。1v晶体出现期2015⁃07⁃3116：2544眼囊中出现椭圆的晶状体。1w肌肉效应期2015⁃07⁃3118：20115胚胎出现微弱断续的收缩，由背部肌节向尾部传递。1x心跳期2015⁃07⁃3119：1050位于眼囊下方与卵黄球之间的心脏开始微弱搏动，约20次/min。1y耳囊出现期2015⁃08⁃0112：001010外观形态呈椭圆形，较明亮的空腔，位于脑后方。1z耳石出现期2015⁃08⁃0118：00360位于耳囊中，耳石形态清晰可辨，体视镜下呈透亮心形状。1a1出膜前期2015⁃08⁃0212：201100胚胎在膜内剧烈翻滚，卵黄球占据膜内大部分空间，呈淡黄色，眼球分布黑色素细胞，体侧集聚不规则黑褐色斑状，心跳达到120次/min。1b1出膜期2015⁃08⁃0217：10290尾部先破膜而出，躯体不断挣扎破膜。1c1刚出膜的仔鱼2015⁃08⁃0217：2313出膜的仔鱼侧卧水底，全长3．66mm。1d1平游的仔鱼2015⁃08⁃0716：407157口裂形成，卵黄球消失，鳔充气，尾鳍开始角质化，能平游觅食。1e1成熟卵细胞2015⁃07⁃299：30—视野中外观形态呈圆形，充满卵黄，卵径为1．03mm。1f1

2.2 胚胎各阶段发育历时

因采用半人工繁殖，受精卵胚盘形成阶段推测历时为约1 h，卵裂阶段历时4.50 h、囊胚阶段历时3.08 h、原肠胚阶段历时1.58 h、神经胚形成阶段历时3.43 h、器官形成阶段历时64.07 h和孵化出膜阶段历时0.22 h。在水温(17.5±1.0) ℃条件下，秀丽高原鳅约77.75 h孵化出膜(表1)。

2.3 胚胎心跳变化

首次记录胚胎心跳为20次/min，由受精卵至记录第一次心跳历时约34.42 h(表1)。

自20次/min记录始，胚胎心跳无规律，16.62 h后，心跳达到82次/min，随着器官发育的持续，心跳达到100次/min，刚出膜的仔鱼心跳达到120次/min(图2)。

3 讨论

3.1 秀丽高原鳅人繁关键条件与适应性

秀丽高原鳅野生群体分布于海拔2190 m的鹤庆盆地伴山龙潭(龙潭水源来自伴山涌泉)[11]，夜间常匐于敞水区底部的水草之间，秀丽高原鳅与鳅科大部分种类一样，体型小[12]，开展人工繁殖时，与泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)类似[13]，选择半人工方式，避免人工挤卵造成亲鱼大量死亡。通过注射催产素(促黄体素释放激素类似物、人绒毛膜促性腺激素)进行人工繁殖，获得受精卵，表明与“四大家鱼”一样[14]，在高原鳅属鱼类中，可通过注射外源性激素对其繁殖进行人工干预，为秀丽高原鳅野生种群的人为补充提供了可能。在水温17.0 ℃条件下，秀丽高原鳅催产效应时间约24 h，较泥鳅在23.0 ℃条件下，效应时间13 h要长[15]。该研究中，受精卵黏于筛绢上，胚胎孵化期间，卵粒未脱落，表明秀丽高原鳅属黏性卵，与安氏高原鳅微黏性、贝氏高原鳅、叶尔羌高原鳅卵的特性一致[7,9-10]。同时，秀丽高原鳅卵的特性表明与环境的适应，自然产卵繁殖时，受精卵能黏于龙潭水草上自然孵化。

图2 秀丽高原鳅胚胎心跳变化

图1 秀丽高原鳅胚胎发育a.受精卵；b.胚盘隆起；c.2细胞期；d.4细胞期；e.16细胞期；f.32细胞期；g.64细胞期；h.多细胞期；i.囊胚早期；j.囊胚中期；k.囊胚晚期；l.原肠早期；m.原肠中期；n.原肠晚期；o.神经胚期；p.胚孔封闭期；q.体节出现期r.眼基出现；s.眼囊出现期；t.尾芽形成；u.尾芽出现期；v.尾芽游离期；w.晶体出现期；x.肌肉效应期；y.心跳期；z.耳囊出现期；a1.耳石出现期；b1.出膜前期；c1.出膜；d1.刚出膜的仔鱼；e1.平游的仔鱼；f1.成熟卵细胞.

3.2 胚胎发育的关键因子影响

鱼类胚胎发育具有各自物种的特异性，主要受遗传因素影响，同时，在发育过程中，也受水温、溶氧、光照等外因的影响[16]，在(17.5±1.0) ℃条件下，秀丽高原鳅孵化时间约77.75 h，西昌高原鳅在(22.0±0.5) ℃条件下，孵化时间93 h；安氏高原鳅在水温(16.3～18.1) ℃时，孵化时间119.73 h，贝氏高原鳅在9.0～12.8 ℃条件下，孵化时间287 h，叶尔羌高原鳅在(20.0±1.0) ℃条件下，历时65.57 h孵化出膜。在已报道的高原鳅属鱼类中，秀丽高原鳅与叶尔羌高原鳅胚胎发育时间较接近；但在水温条件基本一致时，秀丽高原鳅的胚胎发育时间远小于安氏高原鳅[7-10]。

3.3 胚胎发育过程中卵黄的形态与吸收

秀丽高原鳅胚胎发育阶段与细鳞裂腹鱼(Schizothoraxchongi)[17]、鲈鲤(Percocyprispingi)[18]、鲤鱼(Cyprinuscarpio)[19]等大部分硬骨鱼类似，可分为7个阶段，在时序上因外环境的因素，呈现提早或推迟现象。随着器官的形成，圆球形的卵黄囊逐渐变为出膜时的长椭圆状，在(17.5±1.0) ℃条件下，120 h后，卵黄消耗完毕，开始平游觅食，卵黄的吸收时间与，贝氏高原鳅仔鱼在水温4.0～15.0 ℃条件下，经192 h吸收完[9]，光唇裂腹鱼(S.lissolabiatus)仔鱼在水温15.0～17.0 ℃条件下，卵黄经216 h吸收完[20]，叶尔羌高原鳅仔鱼在(20.0±1.0) ℃条件下，卵黄经96～120 h吸收完，开始摄食[10]。同属鱼类中，适温条件下，卵黄的吸收时间与水温呈负相关，即水温越低，卵黄消耗时间越长，与鱼类生长周期中温度对代谢速率的影响基本一致[21]，不同属的鱼类中消耗时间与卵黄体积的关系还需进一步研究，不同物种的野外生境以及遗传特性，表现出不同的繁殖策略及胚胎发育过程。

3.4 心跳特征比较

秀丽高原鳅第一次心跳约为授精后34.42 h，为20次/min，至刚出膜时120次/min。安氏高原鳅授精后52.5 h，心脏开始搏动，心跳起始为3～11次/min，至53 h后心跳约55次/min[7]；贝氏高原鳅授精后168.8h心脏开始搏动，心跳为10次/min，授精后186.3,心跳为29次/分，至授精后248.5 h心跳为53次/min[9]；叶尔羌高原鳅约为授精后48 h出现心脏搏动[10]。胚胎发育过程中心脏搏动同属各物种呈无规律状，推测心跳变化的差别具有物种先天的特征和自身的属性。

通过对秀丽高原鳅人工繁殖条件的探索和受精卵收集和孵化技术的研究，为实现秀丽高原鳅人工增殖放流奠定了基础条件，以期有效减缓自然种群的捕捞压力和应对水域环境剧烈变化。秀丽高原鳅仔鱼平游觅食后，开口饵料以及培育技术仍需做进一步的研究。

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