草鱼病原菌AvX005的分离鉴定及其拮抗菌筛选研究

何 涛，邹 升，龚 亮，赵 峰，周朋吉，李艳平，曹丽娜，丁学知，夏立秋

( 湖南师范大学 生命科学学院，淡水鱼类发育生物学国家重点实验室，微生物分子生物学省重点实验室，湖南 长沙 410081 )

草鱼(Ctenopharyngodonidellus)作为我国产量较大的淡水鱼类养殖品种，具有生长快、饲料蛋白需求低、肉质好等优点[1]。然而随着草鱼集约化养殖规模不断扩大、养殖密度增加，导致养殖水质变差，草鱼重大病害爆发日益频繁，其中细菌性疾病最为严重，制约和危害了草鱼养殖业的健康可持续发展。2016年4—7月，湖南望城乔口渔场爆发了较大范围的草鱼疾病，发病草鱼均表现为游动缓慢、反应迟钝，体表发黑，胸鳍鳍条基部和局部鱼体肌肉出现出血症状，肛门红肿，鳃丝呈灰白，部分鱼体出现脱鳞。该病持续时间长，短期内可导致草鱼大量死亡。因此分离并鉴定草鱼细菌性疾病病原对草鱼病害的有效防治具有重要意义。

我国水产养殖动物细菌性疾病防治中，抗菌类药物发挥了重要作用[2]。然而此类药物的过量使用，也带来了越来越多的问题，如病原菌的抗药性，养殖水体的菌群失调，以及药物残留对生态环境污染问题[3]。近年来，生物防治成为研究热点，拮抗菌以其无残留、绿色安全等优点逐渐替代抗生素，得到越来越多的关注。目前研究比较多的水产益生菌主要有乳酸菌、芽孢杆菌(Bacillus)、光合细菌、硝化细菌等，其中部分已被广泛应用于水质调控和饲料添加剂，然而在针对特定病原的拮抗菌研究相对较少。因此，加强病原菌拮抗菌的理论研究和应用开发，有助于更快、更好的服务于水产养殖业。笔者自湖南望城乔口爆发病鱼池的病鱼体内分离纯化获得一株优势菌株，经回复感染试验能使草鱼致死，对该病原菌进行了生理生化特性和分子鉴定，并筛选其拮抗菌，分离纯化抑菌活性物质，利用LC-MS/MS鉴定该物质及其分子量，以期为渔场该病原的检测和生物防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

患病草鱼及本试验草鱼均为常规草鱼品种，患病草鱼取自爆发鱼病的湖南望城乔口渔场，每尾体质量约100 g，体长约12 cm。健康草鱼取自实验室养殖基地，每尾体质量约100～120 g，于实验室水族箱饲养，用于后续试验。

1.2 培养基

LB液体培养基：蛋白胨10 g， 酵母提取物5 g，氯化钠10 g， 超纯水1000 mL；LB固体培养基：在液体LB培养基中加2%的琼脂粉。发酵培养基：葡萄糖18 g，蛋白胨14.5 g，KH2PO42.5 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，MnSO40.02 g，FeSO4·7H2O 0.02 g，超纯水1000 mL。

1.3 主要试剂及仪器

细菌基因组提取试剂盒，PMD-18T载体，质粒提取试剂盒，PCR产物纯化试剂盒均购自上海生工生物试剂有限公司；TaKaRa Ex TaqDNA 酶，DL-5000Marker购自宝生物工程(大连)有限公司。冷场电子扫描显微镜(Hitachi Su8010)购自日立公司，超高效液相色谱仪UHPLC(Agilent 1290)购自美国安捷伦公司，凝胶成像仪购自美国Kodak公司，PCR 扩增仪购自德国Eppendorf公司，电泳仪购自北京六一仪器厂。

1.4 病原菌的分离

将同一批具有典型症状的患病草鱼，用75%的酒精棉擦拭体表后于超净工作台中无菌条件下解剖，分别取鳃、心、肝、胰、肾组织加无菌水研磨捣碎，吸取上清液稀释涂布于固体LB培养基平板中，37 ℃培养24 h后挑取优势单菌落再次划线纯化，纯化的菌株接种于液体LB培养基中于37 ℃恒温振荡培养箱中培养18～20 h，保种于25%无菌甘油中，冰箱中-80 ℃冻存备用。

1.5 回复感染试验

取冰箱中-80 ℃冻存的菌株活化，扩大培养后，离心收集菌体，用0.85%无菌生理盐水将其稀释制备成1×109cfu/mL、1.0×108cfu/mL的菌悬液。将试验用的健康草鱼随机分组，每组10尾。试验采用曝晒24 h后的自来水作为养殖水体，水温控制在20～23 ℃，采用腹腔注射法。腹腔注射分为3组：第1组注射1.0×109cfu/mL菌悬浮液，第2组注射1.0×108cfu/mL菌悬浮液，对照组注射0.85%无菌生理盐水，注射量均为0.2 mL/尾。观察14 d，记录鱼体症状和死亡情况。患病试验鱼按照1.4方法进行细菌的再分离。

1.6 病原菌的分类与鉴定

1.6.1 病原菌形态观察

病原菌在LB培养基上于37 ℃培养20 h后，观察和记录菌落形态特征。挑取单菌落于载玻片上滴加3～5 μL的无菌水制成菌悬液，进行涂片、固定和革兰氏染色后在ZISS光学显微镜下观察菌体形态。同时将细菌涂布制片，在冷场电子束扫描电子显微镜下观察菌体超微结构。

1.6.2 分子鉴定

1.6.2.1 16S rDNA的扩增与测序

菌株于37 ℃振荡摇床培养16 h，利用细菌基因组提取试剂盒(生工)提取细菌基因组，利用通用引物扩增维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)的16S rDNA的全长序列，引物序列为：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，序列预期长度约为1500 bp。PCR反应体系20 μL。含有10× PCR Ex Taq Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 1.6 μL，上游引物0.6 μL(10 pmol/L)、下游引物 0.6 μL(10 pmol/L)，模板 1 μL，TaKaRa Ex Taq(5 U/μL) 0.2 μL，ddH2O 14 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性45 s，55 ℃复性45 s，72 ℃延伸2 min，30个循环，最后延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测并回收。回收产物用PMD-18T vector进行连接，之后转化到大肠杆菌(Escherichiacoli)Top10感受态细胞中，进行氨苄抗性筛选，挑取单克隆培养提取质粒，酶切鉴定后送至上海生工进行测序。

1.6.2.2 系统发育树的构建

将测序获得的序列利用BLAST和GenBank数据中序列进行同源性分析。根据比对结果，在GenBank中检索获得标准菌株的16S rDNA序列，利用Mega 6.0软件采用邻接法构建系统发育树(重复数为1000，步长值取百分比)。

1.6.3 生理生化鉴定

参照《细菌系统鉴定手册》[4]中的细菌鉴定方法，测定菌株各项生理生化项目，每项测试均设置对照。

1.7 拮抗菌的筛选

1.7.1 候选菌株分离

采集池塘水和底泥样品，称取10 g底泥和量取10 mL水样加入90 mL的无菌水中，超净工作台中蜗旋振荡摇匀，然后吸取上清液以10倍梯度稀释法稀释，取稀释后的样品各100 μL涂布于固体培养基平板，每个稀释梯度涂布3个平板，最后将平板倒置于37 ℃恒温培养箱中培养24～36 h，选择合适菌落数的平板(30～300 cfu)，挑取单菌落进行平板划线纯化，经多次划线纯化后，得到纯菌种，4 ℃保存备用。

1.7.2 拮抗菌的初筛

将培养至对数期的菌株AvX005菌液，取100 μL菌液均匀涂布于固体LB培养基平板，等平板表面在超净台里面风干后，用接种环挑取从池塘水和底泥中分离纯化的菌株点种于涂布有菌株AvX005菌液平板培养基的表面。在30 ℃培养24 h后观察点种菌落周围是否产生抑菌圈。对周围产生抑菌圈的菌落进行分离纯化，直至获得对菌株AvX005具有拮抗作用的纯培养物。

1.7.3 拮抗菌的复筛

将初筛的菌株接种至液体发酵培养基中，于30 ℃，165 r/min的摇床培养48 h，然后取其摇瓶中发酵液于离心机，13 000 r/min离心20 min，取其上清液10 μL滴于滤纸片上。将菌株AvX005活化后，取对数期100 μL菌液涂于LB固体琼脂培养基表面，风干后，用镊子捏取含发酵液的滤纸片贴于平板琼脂培养基的表面，30 ℃培养24 h，观察并测量抑菌圈的直径。

1.8 拮抗成分理化性质的研究及分离鉴定

1.8.1 生物活性测定

将培养48 h的解淀粉芽孢杆菌发酵液(10 000 r/min离心20 min)取上清液分别经温度40、60、80、100 ℃处理1 h后，各取10 μL用于抑菌试验。蛋白酶K(20 mg/mL)处理1 h后，灭活蛋白酶K，各取10 μL用于抑菌试验。pH梯度 1、3、5、7、9、11、13处理1 h后调pH至中性，各取10 μL用于抑菌试验。

1.8.2 超高效液相色谱分离

取发酵48 h的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)发酵液100 mL，4 ℃，10 000 r/min离心20 min收集发酵上清液，用6 mol/L HCl调pH为2，冰箱4 ℃静置12 h，然后10 000 r/min离心20 min收集沉淀，烘干，加入甲醇抽提，再加入少量无菌水用NaOH调为pH 7.0，10 000 r/min离心20 min，取上清液放置真空浓缩仪中冷冻干燥，2 mL 50%甲醇溶解，0.22 μm孔径滤膜过滤，以进样量为10 μL进行超高效液相色谱分离。所用柱子为ZORBAX SB-C18(4.6×150 mm，5 μm)，所用仪器为Agilent 1290 Infinity。流动相A1为ddH2O，B1为乙腈，流速0.5 mL/min，运行方法见表1。0～20 min乙腈5%～100%，20～22 min乙腈100%，22～24 min乙腈100%～5%，24～25 min乙腈5%，检测波长分别为235、250、275 nm。将收集到的组分在真空浓缩仪中冻干，除去乙腈，加入50%甲醇溶解，然后进行抑菌活性检测。

1.8.3 质谱鉴定

在经超高效液相色谱分离收集的样品中添加0.1%的甲酸，进样20 μL于LTQ XL液质联用仪，所用柱子为C18柱，流动相为10%～90%甲醇梯度，检测波长为UV 235、250、275 nm，ESI离子源。喷雾压力为35 psi，干燥气(N2)流速为12 L/min，温度为300 ℃。离子化电压为4000 V，二级质谱中氦气为碰撞气体，全扫描模式。

表1 色谱梯度洗脱程序

2 结果与分析

2.1 病鱼患病症状

发病草鱼表现为游动缓慢、反应迟钝，体表发黑，胸鳍鳍条基部和局部鱼体肌肉出现出血症状，肛门红肿；剖检可见体内肝胰脏、脾脏、肾脏等有不同程度的肿胀，肠腔内有淡黄色的腹水。

2.2 分离菌的形态特征

自患病草鱼的鳃、肝、心、胰脏中分离到菌落形态一致、大小、颜色均一的优势菌(编号为AvX005)。该菌在37 ℃固体LB培养基中菌落见图1，呈灰白色圆形，直径约为2 mm。表面光滑、湿润、中央隆起、边缘整齐。(分离到的菌株AvX005经冷场电子束扫描电镜观察，菌株呈短杆状，两端钝圆，散落或聚集分布(图2)。

图1 AvX005菌株的菌落形态

图2 AvX005菌株扫描电镜观察

2.3 回复感染试验测定

将分离菌株进行回复感染试验，其结果见表2。试验结果表明该菌株对草鱼具有较强的致病性，其病症与自然患病的症状相似。对照组注射0.85%无菌生理盐水的草鱼未出现死亡和发病病症。取感染试验草鱼病变组织进行细菌分离，分离得到大量与原分离菌株形态及生理生化特性一致的菌株，表明所分离的菌株是此次鱼病爆发的病原菌。

表2 回复感染试验结果

2.4 生理生化特征分析

菌株AvX005为革兰氏阴性短小杆菌，具有运动性，V-P反应和吲哚反应为阳性，葡萄糖氧化发酵等部分生理生化指标测定结果见表3。

表3 菌株AvX005的生理生化试验结果

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性.

2.5 菌株AvX005的16S rDNA扩增及系统发育分析

分离菌株的全基因组DNA提取凝胶电泳图中条带清晰(图3)。该菌用16S rDNA的通用引物进行PCR扩增获得长度约为1500 bp的特异性条带(图4)。将16S rDNA扩增测序结果进行BLAST比对分析显示，该菌与已知维氏气单胞菌B7具有最高相似性，序列相似性达到99%。利用Mega 6.0的Kimura-2-Parameter模型，运用邻接构建系统发育树见图5，显示该菌与维氏气单胞菌聚为一支，结合菌株的形态，16S rDNA序列分析(图6)和生理生化表型特征，将该菌株AvX005命名为维氏气单胞菌AvX005，该菌株16S rDNA序列在GenBank上获得的登录号为KU64116.1。

图3 菌株AvX005的总DNA

图4 菌株AvX005的16S rDNA扩增 M: DL 5000 DNA Marker；1～2: 16S rDNA基因片段检测.

图5 根据16S rDNA基因序列构建系统发育树

Aeromonassp. mixed culture J7-6(气单胞菌J7-6)；A.veroniiB565 strain B565(维氏气单胞菌B565)；Aeromonassp. CSTL-6(气单胞菌CSTL-6)；A.veroniistrain IQ105(维氏气单胞菌IQ105)；A.veroniistrain E65(维氏气单胞菌E65)；Aeromonassp. MK2(2010)(气单胞菌MK2)；A.veroniistrain B7(维氏气单胞菌B7)；A.veroniistrain X005(维氏气单胞菌X005)；A.enteropelogenesstrain CECT4487(肠棕气单胞菌CECT4487)；A.sanarelliistrain A2-67(圣雷利气单胞菌AE122)；A.caviaestrain CECT 838(豚鼠气单胞菌CECTCECT 838)；A.lacusstrain AE122(湖泊气单胞菌AE122).

图6 维氏气单胞菌AvX005与维氏气单胞菌 B7 的16S rDNA序列差异A:维氏气单胞菌B7的16S rDNA序列；B:维氏气单胞菌AvX005的16S rDNA序列.

2.6 拮抗菌筛选

2.6.1 菌株的初筛

自鱼塘底泥和水样中分离得到344株菌，采取点种法进行筛选，得到10株产生较大透明圈的菌株。

2.6.2 菌株的复筛

通过对初步筛选得到的10株菌，进行抑菌活性测定，得到5株较高产抑菌物质的产生菌，编号为Pa.1、BS、BS1、B1和B2，菌株活性测定见图7，菌株BS抑菌活性最好，分子生物学方法鉴定为解淀粉芽孢杆菌，系统发育见图8。生理生化特征为：革兰氏染色呈阳性，能利用葡萄糖进行氧化发酵，水解淀粉，明胶液化，蛋白胨水解，甲基红和吲哚试验呈阴性，V-P试验呈阳性，这符合解淀粉芽孢杆菌的生理生化基本特征。

2.7 拮抗菌发酵液的理化性质

解淀粉芽孢杆菌发酵上清液抑菌活性随温度的升高整体改变较大，低于80 ℃时保持较高活性，高于80 ℃时，活性降低较快；pH中性条件下抑菌活性最好，强酸环境中活性保持较好，强碱环境中几乎失活；蛋白酶K处理后活性仍保持较好(表4)。

图7 拮抗菌株的发酵上清液对维氏气单胞菌的拮抗效果

图8 根据16S rDNA基因序列构建系统发育树Bacillus amyloliquefaciens(解淀粉芽孢杆菌)，B. subtilis(枯草芽孢杆菌)，B. velezensis(贝莱斯芽孢杆菌)，B. methylotrophicus (甲基营养芽孢杆菌).

条件抑菌圈直径/mm温度40℃8．30±0．2060℃7．26±0．2580℃6．47±0．25100℃5．26±0．21pH17．26±0．1537．50±0．1057．50±0．1078．16±0．0597．36±0．15113．36±0．15132．10±0．10蛋白酶K6．33±0．21CK(发酵上清液)8．33±0．21

2.8 拮抗菌活性物质分离

解淀粉芽孢杆菌抑菌活性产物分离见图9，分别收集A1到A7洗脱峰，冷冻干燥后溶解于50%甲醇溶液，各取10 μL进行抑菌试验，结果显示A5洗脱峰对维氏气单胞菌有明显的拮抗效果(图10)。修改UHPLC运行方法，对A5洗脱峰在超高效液相色谱仪上进一步分离，检测波长为275 nm，得到洗脱峰B1、B2(图11)，B1出峰时间为3.065 min，B2出峰时间为8.909 min，分别收集洗脱峰B1、B2，冷冻干燥后50%甲醇溶液溶解(浓缩10倍)，各取10 μL进行抑菌试验，结果显示，B2对维氏气单胞菌有明显的拮抗效果(图12)。

图9 解淀粉芽孢杆菌活性产物超高效液相色谱分离A1～A7：解淀粉芽孢杆菌活性产物洗脱峰被分成7组，并分别收集.

图10 解淀粉芽孢杆菌粗提物色谱洗脱峰抑菌活性检测A：维氏气单胞菌拮抗试验，A1～A7：各洗脱峰；CK：解淀粉芽孢杆菌发酵上清液.

图11 解淀粉芽孢杆菌抑菌活性物A5组分的超高效液相色谱分离B1～B7：解淀粉芽孢杆菌活性产物洗脱峰被分成2组，并分别收集.

图12 解淀粉芽孢杆菌B1、B2洗脱峰活性检测CK1：无菌水；CK2：50%甲醇溶液；B1，B2：浓缩10倍的洗脱峰；CK：浓缩10倍的解淀粉芽孢杆菌抑菌活性粗提物.

2.9 质谱鉴定

超高效液相色谱仪上分离解淀粉芽孢杆菌活性峰B2，浓缩10倍，LTQ-XL质谱仪对B2进行鉴定，结果显示，该抑菌活性物质荷为1045.29 [M-H]-(m/z)，可知其分子量为1045.29(图13)。结合二级质谱图发现B2离子峰所裂解出的碎片离子较多(图14)，可推知B2化合物较稳定。

图13 解淀粉芽孢杆菌抑菌活性物质B2一级质谱图

图14 解淀粉芽孢杆菌抑菌活性物质B2二级质谱图

3 讨 论

3.1 病原菌分离与鉴定

维氏气单胞菌属弧菌科、气单胞菌属，1987年，Hickman-Brenner等[5]首次将此菌确定为该属中的一个新种。该菌广泛存在于淡水的河流、湖泊、池塘等多种水域环境，是一种致病性较强的人鱼畜共患致病菌[6-7]，对水产养殖业和人都具有一定的危害性。近年来国内已报道可被维氏气单胞菌感染的水产动物包括黄鳝(Monopterusalbus)、胭脂鱼(Myxocyprinusasiaticus)、鳗鲡(Anguilla)、中华鳖(Trionyxsinensis)、罗非鱼(Oreochromis)、异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)、南方鲇(Silurusmeridionalis)稚鱼、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)、胡子鲇(Clariasfuscus)等[8-16]，主要病症为患病个体出血及腹水。本试验患病草鱼除了上述症状外，还出现鳞片脱落和鳃丝呈灰白色等症状。维氏气单胞菌可感染的水产动物种类和发病范围逐年扩大，因此快速分离鉴定出病原菌是有效防治鱼类疾病爆发的必要条件。水产养殖中鱼类细菌性病原的诊断方法有很多，主要包括生理生化特性鉴定技术(如API检测试剂盒)[17]、免疫学诊断技术(如间接ELISA)[18]、分子生物学技术(如LAMP)[19]等。PCR检测方法操作简单、准确、快速，可用于草鱼病原维氏气单胞菌的快速检测。本研究从湖南望城乔口爆发病鱼池病鱼的病变组织分离到的一株优势菌，菌株16S rDNA全长1508 bp，在NCBI上经BLAST分析，结果显示，与维氏气单胞菌B7具有最高相似性；不同的是菌株AvX005在第12、385、644、1504碱基位置上出现差异，分别为C、C、G、G，而维氏气单胞菌B7分别为A、T、A、A，菌株AvX005在第1碱基位置上比维氏气单胞菌B7多了一个A，结合生理生化特征鉴定等确定该菌株为维氏气单胞菌(基因登录号：KU64116.1)，命名为维氏气单胞菌AvX005，经回复感染试验显示，该菌具有较强的致病性。试验鱼发病症状与自然发病症状相似，从感染试验的患病草鱼体内分离获得大量与原分离菌株形态及生理生化特性一致的菌株，确定所分离的维氏气单胞菌是此次爆发性疾病的病原。已有研究表明，维氏气单胞菌也是湖南省草鱼疾病的主要病原菌之一[20]。

3.2 拮抗菌的筛选

拮抗菌的筛选通常采用体外试验方法，纸片法是常用的方法之一。指示菌为病原菌，指标是待测菌能够在琼脂培养基上对指示菌产生抑制效果[21]。本试验以病原维氏气单胞菌为指示菌，自养殖池塘底泥中筛选了一株活性较好的解淀粉芽孢杆菌，其抑菌直径达8.3 mm。目前，国内外关于水产病原性维氏气单胞菌拮抗菌的筛选研究极少，国内仅李联泰等[22-23]对维氏气单胞菌进行了拮抗菌的筛选及对其拮抗物质、生长条件做过相关研究。因此，本试验筛选到的拮抗菌进一步丰富了维氏气单胞菌的拮抗菌资源。利用拮抗微生物抑制水体中病原微生物的生长，使病原菌的密度低于其致病密度，进行水产养殖病害的防治，是国内外水产养殖病害控制的热点[24]。解淀粉芽孢杆菌是一种对人畜相对安全的细菌，可作为候选益生菌有望在水产养殖中得到应用。

3.3 抑菌活性物的初步研究

解淀粉芽孢杆菌作为重要的生防细菌，其抑菌活性范围非常广。如解淀粉芽孢杆菌R3[25]、Es-2[26]可以有效抑制致病性细菌，解淀粉芽孢杆菌SQR9[27]、PPCB004[28]可以有效抑制植物病原真菌。然而在水产养殖益生菌的应用研究中关于解淀粉芽孢杆菌拮抗鱼类病原菌的抑菌活性产物的分离鉴定研究报道甚少。Nair等[29]通过营养肉汤培养基筛选到假单胞菌(Pseudomonas)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(B.pumilus)对创伤弧菌(Vibriovulnificus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophilia)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、哈维弧菌(V.harveyi)、鳗弧菌(V.anguillarum)有明显拮抗作用，然而没有对其抑菌活性物进行分离鉴定。本研究筛选的解淀粉芽孢杆菌发酵上清液对维氏气单胞菌具有拮抗作用，表明它能生产胞外抗细菌活性成分，将发酵上清液调至pH 2.0时，产生能抗菌的沉淀(上清液无抑菌活性)，沉淀经甲醇溶解的溶液仍具有抑菌活性，表明可采用酸沉醇提方法提取抑菌活性物质。酸沉醇提法[30]主要用于提取发酵上清液中的脂肽类物质。众多研究表明，解淀粉芽孢杆菌能够产生伊枯草菌素、芬荠素和表面活性素的脂肽类抗生素，具有广泛抑制真菌与细菌的能力[31]。本研究筛选到的解淀粉芽孢杆菌抑菌活性物的抑菌活性随温度的升高整体改变较大，低于80 ℃时保持较高活性，高于80 ℃时，活性降低较快；pH中性条件下抑菌活性最好，强酸环境中活性保持较好，强碱环境中几乎失活；对蛋白酶不敏感。质谱鉴定其活性物质分子量为1045.29，这与已有研究报道解淀粉芽孢杆菌产生的脂肽类化合物理化性质相似，化合物分子量接近。因此初步推测此抑菌活性物可能为一种脂肽类化合物，对其活性物质进行结构解析和确定及其对维氏气单胞菌抑菌作用机理仍待进一步研究。

[1] 隗黎丽, 王自蕊, 杨竹青. 草鱼2株气单胞菌的分离与鉴定[J]. 水产科学, 2013, 32(6):348-352.

[2] 乔毅, 万夕和, 沈辉. 我国水产用抗菌药物耐药性研究进展[J]. 中国抗生素杂志, 2015, 40(5):389-395.

[3] Zorriehzahra M J, Delshad S T, Adel M, et al. Probiotics as beneficial microbes in aquaculture: an update on their multiple modes of action: a review[J]. Veterinary Quarterly, 2016, 36(4):228-241.

[4] 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京:科学出版社, 2007:320-418.

[5] Hickman-Brenner F W, Macdonald K L, Steigerwalt A G, et al.Aeromonasveronii, a new ornithine decarboxylase-positive species that may cause diarrhea[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1987, 25(5):900-906.

[6] Janda J M, Abbott S L. The genusAeromonas: taxonomy, pathogenicity, and infection[J]. Clinical Microbiology Reviews, 2010, 23(1):35-73.

[7] Khajanchi B K, Fadl A A, Borchardt M A, et al. Distribution of virulence factors and molecular fingerprinting ofAeromonasspecies isolates from water and clinical samples: suggestive evidence of water-to-human transmission[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2010, 76(7):2313-2325.

[8] 陈红莲, 江河, 胡王, 等. 黄鳝病原性维氏气单胞菌温和生物变种的分离与鉴定[J]. 生物技术通报, 2014(3):130-136.

[9] 黄文明, 王利, 冀国桢, 等. 胭脂鱼维氏气单胞菌和中间气单胞菌的鉴定及药物敏感性[J]. 水产科学, 2013, 32(4):210-214.

[10] 杨求华, 郭松林, 关瑞章, 等. 鳗鲡病原性维氏气单胞菌的分离与鉴定[J]. 生物技术通报, 2012, 13(7):134-139.

[11] 沈文英, 李卫芬, 高研, 等.中华鳖病原维氏气单胞菌的分离与鉴定[J].水生生物学报，2010, 34(5):1060-1064.

[12] 李聪, 蔡岩, 周永灿, 等. 海南罗非鱼致病性维氏气单胞菌分离鉴定及药敏特性研究[J]. 水产科学, 2015, 34(10):640-646.

[13] 夏飞, 梁利国, 谢骏. 异育银鲫病原维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 淡水渔业, 2012, 42(5):22-26.

[14] 蒋礼平, 梁勤朗, 李云兰, 等. 南方鲇稚鱼爆发性死亡的病原鉴定[J]. 淡水渔业, 2014(3):56-61.

[15] 徐洋, 蔺凌云, 姚嘉赟, 等. 黄颡鱼 "溃疡综合征" 病原的分离鉴定及药敏试验[J]. 淡水渔业, 2015, 45(5):100-104.

[16] 龙苏, 韩书煜, 牛志伟, 等. 胡子鲶致病性气单胞菌的分离鉴定及其致病力与毒力基因型相关性[J]. 水产学报, 2016, 40(3):308-317.

[17] Abdel-Aziz M, Eissa A E, Hanna M, et al. Identifying some pathogenicVibrio/Photobacteriumspecies during mass mortalities of cultured gilthead seabream (Sparusaurata) and European seabass (Dicentrarchuslabrax) from some Egyptian coastal provinces[J]. International Journal of Veterinary Science & Medicine, 2013, 1(2):87-95.

[18] Kumar B K, Raghunath P, Devegowda D, et al. Development of monoclonal antibody based sandwich ELISA for the rapid detection of pathogenicVibrioparahaemolyticusin seafood[J]. International Journal of Food Microbiology, 2011, 145(1):244-249.

[19] Thongkao K, Longyant S, Silprasit K, et al. Rapid and sensitive detection ofVibrioharveyi, by loop-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick targeted to vhhP2 gene[J]. Aquaculture Research, 2015, 46(5):1122-1131.

[20] 张德锋, 刘礼辉, 李宁求, 等. 我国南方地区鱼源气单胞菌不同种类的流行特征[J]. 水产科学, 2015, 34(11):673-682.

[21] Kesarcodi-Watson A, Kaspar H, Lategan M J, et al. Probiotics in aquaculture: the need, principles and mechanisms of action and screening processes[J]. Aquaculture, 2008, 274(1):1-14.

[22] 凡飞, 张生武, 李联泰, 等. 凡隆气单胞菌(Aeromonasveronii)拮抗菌4-1-3的筛选鉴定及其活性物质初探[J]. 渔业科学进展, 2015, 36(2):146-152.

[23] 孙梅, 张维娜, 高亮, 等. 解淀粉芽孢杆菌JSSW-LA的分离鉴定及对病原菌拮抗特性[J]. 江苏农业科学, 2016, 44(4):275-279.

[24] 王娟, 封永辉, 蔡立胜, 等. 来自大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)肠道的弧菌拮抗菌的筛选与鉴定[J]. 海洋与湖沼, 2010, 41(5):707-713.

[25] Chi Z, Rong Y J, Li Y, et al. Biosurfactins production byBacillusamyloliquefaciens, R3 and their antibacterial activity against multi-drug resistant pathogenicE.coli[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2015, 38(5):853-861.

[26] Liu H, Sun L, Wang Y, et al. Modeling antimicrobial activity of lipopeptides fromBacillusamyloliquefaciensES-2 againstShewanellaputrefaciensin shrimp meat using a response surface method[J]. Journal of Food Protection, 2012, 75(10):1855-1858.

[27] Li B, Li Q, Xu Z, et al. Responses of beneficialBacillusamyloliquefaciensSQR9 to different soilborne fungal pathogens through the alteration of antifungal compounds production[J]. Frontiers in Microbiology, 2014(5):1-10.

[28] Arrebola E, Jacobs R, Korsten L. Iturin A is the principal inhibitor in the biocontrol activity ofBacillusamyloliquefaciensPPCB004 against postharvest fungal pathogens[J]. Journal of Applied Microbiology, 2010, 108(2):386-395.

[29] Nair A V, Vijayan K K, Chakraborty K, et al. Diversity and characterization of antagonistic bacteria from tropical estuarine habitats of Cochin, India for fish health management[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012, 28(7):2581-2592.

[30] 高学文, 姚仕义, Huong, 等. 枯草芽孢杆菌B2菌株产生的表面活性素变异体的纯化和鉴定[J]. 微生物学报, 2003, 43(5):647-652.

[31] Chen X H, Vater J, Piel J, et al. Structural and functional characterization of three polyketide synthase gene clusters inBacillusamyloliquefaciensFZB 42[J]. Journal of Bacteriology, 2006, 188(11):4024-4036.