云贵川三省部分地区警犬狂犬病血清中和抗体调查

杜晓鹏，刘婷芳，徐 陶，王宇洋，毛爱国，许炜迪，张 垚，王 雄，党西锋，张明飞，冯 烨

（1. 公安部昆明警犬基地，云南昆明 650204；2. 军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春 130122；3. 四川省公安厅警犬基地，四川成都 610041；4. 贵州省公安厅警犬基地，贵州贵阳 550000）

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（RABV）感染引起的一种致死性人兽共患病，病死率几乎高达100%[1]。目前，对狂犬病尚无有效治疗方法，及时接种疫苗是预防狂犬病最有效措施之一[2]。犬狂犬病免疫覆盖率低于70%是诱发人间狂犬病发生的主要原因[3]。2016年全国共报告644例人狂犬病死亡病例。尽管狂犬病疫情整体呈下降趋势，但贵州、四川、云南等省份仍是我国人和动物狂犬病高发地区[4]。

为了解我国警犬狂犬病免疫效果，分析影响警犬免疫合格率的因素，便于制定合适的警犬免疫程序，提高免疫合格率，于2017年对云南、贵州、四川三省部分地区警犬开展了狂犬病免疫血清中和抗体监测。

1 监测对象

1.1 范围

选取云南省昆明市、贵州省贵阳市，以及四川省成都、绵阳、德阳、泸州市等6个训练场3月龄以上、临床检查健康的警犬进行抽样调查，包括幼犬、训练犬、种犬等。

1.2 背景

1.2.1免疫程序 6个地区的警犬免疫程序相同：3月龄时进行第1次狂犬病灭活疫苗注射；1岁以后，每年春季进行1次狂犬病灭活疫苗注射。幼犬在6月龄左右进行科目训练，训练3～6个月调至新工作单位后，其免疫程序并入新单位的年度免疫。

1.2.2疫苗种类 云南省、贵州省选用的是A品牌的犬、猫狂犬病灭活疫苗（Pasteur RIV株，至少2 IU），定义为A组；四川省选用的是B品牌的狂犬病灭活疫苗（HCP-SAD株，灭活前不少于106.3FAID50/mL），定义为B组。

1.2.3犬种 检测的犬种包括德国牧羊犬、马里努阿犬、昆明犬、罗威纳犬、拉布拉多犬、史宾格犬与边境牧羊犬。按照中国工作犬管理协会（CWDMA）的犬种分组表[5]，将检测犬分为大型犬（身高55 cm以上）、中型犬（身高35.1～54.9 cm）与小型犬（身高35 cm以下）。其中，德国牧羊犬、马里努阿犬、昆明犬与罗威纳犬属于大型犬，拉布拉多犬、史宾格犬与边境牧羊犬属于中型犬。此次监测没有小型犬。

2 抽样方法与数量

根据云南、贵州、四川三省的警犬工作布局情况，选取6个对周边工作具有辐射性、警犬数量相对多的单位进行抽样。先将每个抽样单位的犬群以年龄为单位进行分类，即：3～6月龄、7～12月龄和1岁以上3个年龄段，再按下述方法进行抽样：

3～6月龄，每窝犬、每个性别，按照10%的比例进行间隔抽样；7～12月龄，每个单位、每个月龄段、每个性别，按照10%的比例进行间隔抽样；1岁以上，每个单位以每12个月为选择时间段，每个时间段、每个性别，按照10%的比例进行间隔抽样。当每组的警犬总数不超过20只时，间隔抽样可以进行；超过20只时，按照“隔2抽1”或“隔3抽1”原则抽样，以此类推。

根据上述原则，在云南省昆明市某训练场选取56只警犬，在贵州省贵阳市某训练场选取60只警犬，在四川省成都市、绵阳市、德阳市、泸州市4个训练场选取71只警犬，共187只。

3 实验室检测

3.1 材料

3.1.1检测试剂 标准血清：购自法国欧盟狂犬病血清学参考实验室，效价为5.92 IU/mL；阴性血清：采集自未免疫健康犬，由军事兽医研究所的世界动物卫生组织（OIE）狂犬病参考实验制备；FITC荧光素标记的抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体：购自Fujiribio公司；狂犬病病毒CVS-11细胞毒：军事兽医研究所保存，滴度为106.67TCID50/mL。

3.1.2待检血清 从待检犬前肢头静脉采血至少3 mL，静置2 h，1 500 r/min离心30 min，分离血清，冷冻保存或冷链运送至实验室，备用。如出现溶血，需重新采集血样并分离血清。

3.2 方法

3.2.1样本处理 将待检血清56 ℃灭活30 min。

3.2.2检测 采用OIE《陆生动物诊断测试和免疫手册》（2013版）[6]中规定的直接免疫荧光病毒中和试验（FAVN），对待检血清进行RABV中和抗体效价检测。首先对标准血清和待检血清进行3倍梯度稀释，稀释区域第1列各孔内预先加入100µL培养液，每孔加入血清50 µL，混匀后吸取50µL加入第2列，依次稀释。取预先确定滴度的狂犬病病毒CVS-11，以MEM培养液将其稀释至30～300 TCID50/50 µL，除细胞及培养液对照孔外，每孔加入病毒稀释液50 µL，置37 ℃中和1 h。BHK-21细胞经胰酶消化、分散、计数后，稀释至4×105/mL，除培养液对照孔外，每孔加入50 µL细胞悬液，于37 ℃ 5% CO2培养箱培养2 d。弃细胞培养上清，加入50 µL冷丙酮，−20 ℃固定细胞1 h；PBST洗涤后，将RABV核蛋白荧光抗体稀释至工作浓度，每孔加入50 µL工作液，37 ℃孵育1 h；PBST洗涤，荧光显微镜下观察每个孔。孔内有荧光细胞即为感染，为阳性；无荧光细胞为完全中和，为阴性。利用基于Spearman-Karber推导的公式计算待检血清的病毒中和效价。以犬免疫后的血清中和抗体效价≥0.50 IU/mL为阳性标准，达到或超过0.50 IU/mL即具有效保护水平。

3.2.3统计学分析 检测数据采用SPSS18.0及Excel 2007进行分析处理。

4 结果与分析

4.1 总体情况

采集187只警犬血清进行RABV中和抗体效价检测，发现抗体阳性127只，整体免疫合格率为67.91%（表1）。其中，四川省的警犬免疫合格率高于云南省，两者之间差异显著（P＜0.05），具有统计学意义；贵州与云南、贵州与四川之间差异不显著（P＞0.05），不具有统计学意义。

表1 187只警犬RABV中和抗体检效价检测结果

4.2 不同年龄警犬检测

对187只警犬，按照年龄进行分类检测发现，6岁以上警犬的抗体合格率最高，为87.10%，7～12月龄警犬最低，为41.67%。具体见表2。

4.3 不同免疫次数警犬检测

对187只警犬，按照免疫次数进行分组检测，发现免疫4次及以上的合格率最高，为86.79%，免疫1次的最低，仅为53.4%；免疫2次以上警犬的合格率明显高于免疫1次的警犬（P＜0.01）。具体数据见表3。

表2 不同年龄的警犬RABV中和抗体效价检测结果

表3 不同免疫次数警犬的RABV中和抗体效价检测结果

4.4 不同疫苗免疫警犬检测

在选用A品牌疫苗免疫的警犬中，检出阳性73份，免疫合格率为62.93%；而选用B品牌疫苗免疫警犬的合格率为76.06%，差异显著（P＜0.05）。具体见表4。

表4 不同疫苗免疫的警犬RABV中和抗体效价检测结果

4.5 不同体型警犬检测

对187只警犬，按照体型大小进行分类检测发现，中型犬的免疫合格率为65.52%，大型犬为68.35%（表5），两者之间差异不显著（P＞0.05），说明警犬的体型大小对狂犬病免疫合格率影响不大。

表5 不同体型的警犬RABV中和抗体效价检测结果

4.6 不同性别警犬检测

对187只警犬，按性别进行分类检测。结果显示，公犬的免疫合格率为67.39%，母犬为68.42%（表6），两者之间差异不显著（P＞0.05），说明性别对狂犬病免疫合格率影响不大。

表6 不同性别的警犬RABV中和效价检测结果

5 讨论

本次检测的警犬狂犬病总体免疫合格率为67.91%。世界动物卫生组织（OIE）研究表明，狂犬病抗体合格率大于70%，即可有效防控狂犬病传播[7]。本次检测发现警犬的免疫抗体合格率尚没有达到该标准，表明部分警犬的狂犬病免疫效果并不理想。为寻找影响警犬狂犬病免疫效果的因素，本研究分析了不同年龄、不同免疫次数、不同疫苗类型，以及不同体型和性别的检测结果。研究数据表明，警犬狂犬病免疫合格率与犬的年龄、免疫次数、疫苗类型等因素有一定的关系，而与体型和性别关系不大。

检测发现1岁以下幼犬的免疫合格率为41.67～56.14%，而1岁以上警犬的免疫合格率均超过70%。这与Kennedy等[8]的研究结果相同。这是因为年龄较小的犬免疫系统不健全，接种疫苗的效果较差。本研究发现7～12月龄警犬的免疫合格率低于3～6月龄。这可能与其训练时间和调动有关。据调查，警犬从6月龄开始进行训练，3～6个月完成训练科目后，被调往新的工作单位，参加新单位的年度狂犬病疫苗免疫。在此过程中便形成了免疫空档期。因此，为了提高免疫合格率，除对6月龄以下的警犬增加免疫次数外，对于7～12月龄警犬，在离开原训练场前或者调入新单位后应立即注射狂犬病疫苗，以消除免疫空档期。

本研究结果显示，警犬性别、体型对狂犬病免疫合格率影响不大。但有研究表明，中大型纯种犬免疫效果不如小型犬或杂交犬[8-9]，因此可以通过增加免疫次数来提升中大型警犬的抗体水平。在本研究中，免疫2～3次、免疫4次及以上警犬的免疫合格率均明显高于免疫1次的警犬，说明免疫合格率与免疫次数密切相关，免疫次数越多，合格率越高。

本次检测发现，四川省采用的B疫苗免疫效果高于云南、贵州两省的A疫苗，说明不同类型疫苗对警犬的免疫合格率也有影响。

以上检测结果虽然反映出警犬的狂犬病免疫合格率与犬的年龄、免疫次数、疫苗类型等因素有关，且不受警犬性别和体型大小影响。但本次调查仅为横断面调查，如果对每一个影响因素进行连续性分析，结果是否与上述相同，就需后续研究证明。

6 结论与建议

本调查抽检云南昆明市、贵州贵阳市，以及四川成都市、绵阳市、德阳市、泸州市，共6个训练场的187只警犬进行狂犬病免疫抗体检测，发现总体免疫合格率为67.91%，未达到70%的国际标准。这主要是因为1岁以下幼犬的免疫合格率普遍较低，为41.67～56.14%。研究发现免疫次数越高，抗体合格率越高。另外，不同疫苗种类也对免疫效果有影响。

因此应加强对1岁以下幼犬的免疫，对6月龄以下警犬进行2次狂犬病灭活疫苗免疫，即3月龄时进行第1次基础免疫，间隔28 d后进行第2次加强免疫；对7～12月龄警犬，在离开原训练场前或进入新单位后，随即进行1次狂犬病疫苗免疫，以消除免疫空档期。对1岁以上警犬，应继续执行每年1次的疫苗免疫程序，并提高血清中和抗体监测力度，对不合格警犬及时进行加强免疫。

[1] 俞永新. 狂犬病和狂犬病疫苗[M]. 2版. 北京：中国医药出版社，2001，127-142.

[2] 吴泰才，吕元聪，黄志雄，等. 推行犬用口服狂犬病疫苗是控制狂犬病的有效措施[J].广西预防医学，2003，9（2）：113-115.

[3] 姜辉，丛晓丽. 我国狂犬病流行现状及检测预防[J]. 生物技术进展，2011，1（1）：45-49.

[4] 殷文武. 我国狂犬病消除进展及展望[C]//中华预防医学会，中国畜牧兽医学会，中国工作犬管理协会. 2017年中国狂犬病年会论文集. 杭州：中华预防医学会，中国畜牧兽医学会，中国工作犬管理协会，2017：1-2.

[5] 中国工作犬管理协会. 中国工作犬管理协会犬组分组表（2007版）[EB/OL].（2008-08-04）[2017-12-15].http∶//www.cwdma.org/newsdisp.asp?id=7876.

[6] OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals（2013）[M]. Paris：OIE.，2013，267-272.

[7] 周宏鹏，刘拥军，张秀娟，等. 全球狂犬病流行现状及防治策略[J]. 中国动物检疫，2015，32（1）：50-52.

[8] KENNEDY L J，LUNT M，BARNES A，et al. Factors influencing the antibody response of dogs vaccinated against rabies[J]. Vaccine，2007，25（51）：8500-8507.

[9] BERNDTSSON L T，NYMAN A K，RIVERA E，et al.Factors associated with the success of rabies vaccination of dogs in Sweden[J]. Acta veterinaria scandinavica，2011，53（22）：1-7.