两种固相萃取柱在乙酰氨基阿维菌素药动学前处理中的比较

张振东，刘希望，马 宁，申栋帅，李剑勇

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州 730050）

固相萃取（Solid-phase extraction，SPE）是近年发展起来一种样品预处理技术，由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来。其原理是利用组分与吸附剂（固定相）间的选择性吸附与选择性洗脱过程，达到分离、净化和富集的目的[1]。SPE技术与传统的液液萃取法相比有以下优点：（1）在样品分离、纯化和浓缩时，可以提高药物回收率；（2）选择性好，将药物与干扰组分更加有效分离；（3）可实现多样品平行处理，便于自动化，有较高的重现性，有助于提高检测灵敏度；（4）SPE柱的商品化，使其萃取操作更简单、省时[2]。SPE最普遍使用的形式是SPE柱。SPE柱是一种填充好固定相的短色谱柱。当液体样品通过固相吸附层时，基体被除去，待测物被富集，然后用少量溶剂（6～10 mL）洗脱回收待测物[3]。乙酰氨基阿维菌素（Eprinomectin，EPR）是高效、广谱、低残留的兽用最新一代祛虫药物，主要用于防治畜类（特别是产乳期）的虱、螨、蝇等各种体内外寄生虫，应用于奶牛和肉牛的休药期仅为1 d[4]。由于其对家畜体内外各种寄生虫的极高活性，以及在乳品中极低的分配系数，使其成为第一个可用于各种家畜任何生长期的杀虫剂，是一种防治家畜体内外各种寄生虫的首选药剂。EPR脂溶性较高，对其提取和净化较为困难。EPR在动物血液中残留时间较长，因此在动物血液检测中常先用SPE柱对样品进行净化，再经过衍生化，最后用超高效液相色谱-荧光检测器（HPLC-FLD）进行分析检测[5]。本试验通过比较两种SPE柱的EPR净化、萃取效果，为后期EPR的药物代谢动力学研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1标准品 乙酰氨基阿维菌素（B1a含量为95.4%，B1b含量为2.37%，批号K0471411）：中国兽医药品监察所提供。

1.1.2主要试剂 乙睛、甲醇、色谱纯：賽默飞世尔科技（中国）有限公司产品；冰醋酸、分析纯：天津市大茂化学试剂厂生产；N-甲基吡咯烷酮（含量99%）：美国Fisher Scientific公司产品；三氟乙酸酐（含量99%）：美国Fisher Scientific公司产品；蒸馏水、屈臣氏蒸馏水：广州屈臣氏食品饮料有限公司生产；甲酸、质谱纯（含量98%）：日本化成工业株式会社产品。

1.1.3主要仪器设备 高效液相色谱仪（Agilent-LC 1290II）、调速振荡器（VORTEX-2，GENIE®）： 美 国 Scientific Industries公 司 产品；快速蒸发器（LABCONCO®PapidVap）：美国LABCONCO公司产品；离心机（MULTIFUGEX3R）：賽默飞世尔科技（中国）有限公司生产；SPE柱（Bond Elut C18、500 mg、6 mL）：Agilent科技（中国）有限公司生产；SPE 柱（Sep-pak C18、500 mg、6 mL）：Waters科技（上海）有限公司生产。

1.1.4主要溶液配制 衍生化A液：N-甲基咪唑+乙睛（2+7，v/v）；衍生化B液：三氟乙酸酐+乙腈（2+7，v/v）。现配现用。标准储备液的配制：精密称取EPR 102 mg，配制成1.02 mg/mL的A标准储备液，20.4 μg/mL的B标准储备液，2.04 μg/mL的C标准储备液，−20 ℃避光保存。

1.2 方法

1.2.1色谱条件及参数 色谱柱：C18反相色 谱 柱（Eclipse plus C18，RRHD 1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相：乙腈∶水（0.1%的甲酸）=90∶10；流速0.4 mL/min；激发波长365 nm；检测波长 463 nm；柱温35 ℃；进样量 20 μL；检测时间10 min。

1.2.2EPR标准溶液的衍生化与测定 取10 μL 2.04 μg/mL的C标准储备液于磨口的玻璃离心管中，在40 ℃快速蒸发器中吹干；在上述干燥样品中（装于磨口玻璃离心管中）加入200 μL衍生化试剂A液，震荡混匀1 min；加入200 μL衍生化试剂B液，震荡混匀1min；最后加入45 μL冰醋酸，迅速盖上盖，震荡混匀0.5 min。将整个具盖玻璃管置于65 ℃烘箱中衍生化反应30 min，室温放置12 min。用流动相定容至1 mL，混匀后过0.22 mm针筒滤膜，进行HPLC分析检测。共进行6次平行试验，对结果求平均值及相对标准偏差。

1.2.3血浆样品处理、SPE C18柱萃取、衍生化与测定 从−20 ℃中取出冷冻的空白胎牛血清，待其恢复至室温后，取样品0.5 mL，向其中加入10 μL 2.04 μg/mL的C标准储备液，涡旋3 min，静置30 s，然后加入3.5 mL甲醇震荡，混匀20 min，4 000 g离心20 min，合并上清液，提取2次。向上清中加入7 mL蒸馏水（约1∶1稀释），震荡混匀备用。此时应先依次使用3 mL甲醇、3 mL超纯水、3 mL 70%甲醇水溶液，对C18SPE柱进行平衡，然后将混匀后的液体通过C18SPE柱进行萃取，使用3 mL蒸馏水、3 mL 50%甲醇水溶液进行淋洗；使用洗耳球将SPE柱吹干后，使用6 mL甲醇，平均分3次，每次2 mL进行洗脱。将洗脱液收集在磨口的玻璃离心管中，40 ℃下用快速蒸发仪吹干。在上述干燥样品中（装于磨口玻璃离心管中）加入200 μL衍生化试剂A液，震荡混匀1 min，加入200 μL衍生化试剂B液，震荡混匀1 min，最后加入45 μL冰醋酸，迅速盖上盖，震荡混匀0.5 min。将玻璃盖盖紧；将整个具盖玻璃管置于65 ℃烘箱中衍生化反应30 min，室温放置12 min；用流动相定容至1 mL，混匀后过0.22 mm针筒滤膜，进行HPLC分析检测。对这两种SPE柱分别进行6次平行试验，求其平均绝对回收率及相对标准偏差。

1.2.4绝对回收率计算 绝对回收率=经SPE柱萃取的样品药物峰面积/药物标准品峰面积。

2 结果

2.1 EPR及其经不同SPE柱萃取后的衍生化

EPR及其经不同SPE柱萃取后的衍生化结果见表1。

表1 EPR及EPR经不同SPE柱萃取后的衍生化结果

2.2 EPR衍生化峰图

由数据和图谱可得（图1、图2、图3、图4和图5），经Agilent公司的C18SPE柱萃取后，EPR峰形尖锐对称且无明显杂质峰，其平均绝对回收率为94.50%；经Waters公司的C18SPE柱萃取后，EPR峰形尖锐对称且无明显杂质峰，其平均绝对回收率为85.79%。Agilent公司的C18SPE柱与Waters公司的C18SPE柱净化效果相似，但是Agilent公司的C18SPE柱比Waters公司的C18SPE柱萃取EPR的效率更高。

图1 EPR标准溶液的衍生化

图2 Agilent C18 SPE柱-空白血浆衍生化

图3 Waters C18 SPE柱-空白血浆衍生化

图4 AgilentC18 SPE柱-EPR样品衍生化

图5 Waters C18 SPE柱-PER样品衍生化

3 讨论

近年来，随着人们对EPR药物残留及代谢的深入研究，特别是在样品前处理中，越来越多的用到了SPE技术[6]。Nordlander等[7]使用C18SPE柱净化猪肌肉中的伊维菌素，以高效液相-荧光（HPLC-FLD）检测法进行测定。潘保良等[8]应用C18SPE柱净化技术，建立了绵羊血浆中伊维菌素HPLC-FLD检测法。刘迎贵等[9]应用C18SPE柱净化技术，建立了牛、羊、猪肉组织中的伊维菌素残留检测方法。文辉强等[10]在两种EPR浇泼剂在兔体内药代动力学的比较研究中，经过C18SPE柱净化，建立了一套完整的阿EPR浇泼剂HPLC-FLD检测法。高三玉等[11]在高效液相色谱法测定牛奶中EPR残留量研究中，利用C18SPE柱净化，应用HPLC-FLD检测法，建立了一种测定牛奶中EPR残留量的高效液相色谱方法。Dupuy等[12]等利用Agilent公司的C18SPE柱，对水牛血浆进行前处理，利用HPLC-FLD检测法研究了EPR浇泼剂在泌乳期水牛体内的药代动力学。Baoliang等[13]进行了EPR注射液在泌乳奶牛体内的药代动力学研究，将奶牛血浆经过Waters公司的C18SPE柱萃取后，以HPLC-FLD检测法绘制了药时曲线。Wen等[14]进行了EPR浇泼剂和口服糊剂在泌乳期奶牛体内的药物动力学研究，利用C18SPE柱前处理，以HPLC-FLD检测法绘制了两种剂型的药时曲线。

4 结论

本研究表明，Agilent公司和Waters公司的C18SPE柱对EPR的净化效果相似，但Agilent公司的C18SPE柱萃取效率更高。SPE技术在药物代谢动力学中的应用越来越广泛，筛选出一种优质SPE柱是进行药物代谢动力学试验的良好开端，也是试验成功的重要保障。

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