ApoE基因多态性与血脂、氧化低密度脂蛋白、糖尿病足的相关性分析*

叶炳华+孙筱晔+蒋泽+戚文群+唐宝康+倪云

【摘要】 目的：评价载脂蛋白E（ApoE）基因多态性与血脂、氧化低密度脂蛋白（oxLDL）及2型糖尿病（T2DM）患者发生糖尿病足（DF）的相关性，为DF的早期基因诊断提供循证医学的证据。方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测70例T2DM患者（40例DF患者，30例无慢性并发症患者）和48例健康对照者的ApoE基因多態性，比较T2DM患者中并发DF（DF组）与无慢性并发症DM（DM对照组）患者及健康组的ApoE基因型分布和等位基因频率，并利用Logisitic回归分析ApoE基因多态性与DF之间的相关性。结果： DF组ε3/4基因型和ε4等位基因均高于其他两组；ε2/4、ε3/4两组TCH、LDL、oxLDL、HbA1C均明显高于ε2/3、ε3/3两组，HDL则低于上述两组；各等位基因之间比较：ε4组TCH、LDL、oxLDL、HbA1C均显著高于ε2、ε3两组，ε2组TG明显高于ε3、ε4两组；ε3/4基因型和ε4等位基因与发生DF明显相关。结论 ApoE基因多态性与T2DM患者DF的发生相关，基因型ε3/4和等位基因ε4可能是T2DM患者并发DF的危险因子，其机制可能通过血脂代谢紊乱及促进脂质氧化而影响DF的发生。

【关键词】 载脂蛋白E； 糖尿病足； 血脂； 氧化低密度脂蛋白； 2型糖尿病

【Abstract】 Objective：To investigate the association of apolipoprotein E（ApoE） gene polymorphism with diabetic foot（DF） in patients with type 2 diabetes mellitus（T2DM） and hyperlipidemia（LDL），and to provide the evidence of evidence-based medicine for early gene diagnosis of DF.Method：Firstly，polymorphism of ApoE gene was detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP） in 70 T2DM patients（40 with DF while 30 without chronic complications） and 48 healthy controls.Secondly，ApoE genotype distribution and allele frequency of DF（DF group） and non-chronic complications DM（DM control group） patients and health group control group were investigated.Correlation between ApoE gene polymorphism and DF was also analyzed with logistic regression analysis.Result：ε3/4 genotype andε4 allele in DF group were significantly higher than those in the other two groups（P<0.05）.Besides HDL，the levels of TCH，LDL，oxLDL and HbA1c in ε2/4 and ε3/4 were significantly higher than those in ε2/3 and ε3/3（P<0.05）.The levels of TCH，LDL，oxLDL and HbA1c inε4 were significantly higher than those in ε2 and ε3，while the level of TG in ε2 was significantly higher than that in ε3 and ε4（P<0.05）.ε3/4 genotype and ε4 allele were significantly associated with DF.Conclusion：ApoE gene polymorphism is associated with the occurrence of DF in T2DM patients.Genotype ε3/4 and allele ε4 are risk factors probably for DF in T2DM patients.The mechanism may be related to lipid metabolism disorder and lipid oxidation.

【Key words】 Apolipoprotein E； Diabetic foot； Lipid； Oxidized low-density lipoprotein； Type 2 diabetes mellitus

First-authors address：Taizhou Third Peoples Hospital，Taizhou 225321，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.23.013

载脂蛋白E（ApoE）基因具有明显的遗传多态性，ApoE基因多态性已被证实是冠心病的易患因素[1-2]。氧化低密度脂蛋白（oxLDL）亦被认为是冠心病、动脉硬化（AS）的发病机制之一[3]。近年来不少研究证实，ApoE基因多态性与冠心病、脑梗死、糖尿病（DM）伴肾病也密切相关[4-6]，但与oxLDL、糖尿病足（DF）是否相关尚少见报道。本研究通过分别检测DF患者、无慢性并发症DM患者以及健康对照者的ApoE基因多态性、oxLDL，研究两者之间及与2型糖尿病（T2DM）患者发生DF的相关性，试图从遗传基因角度探讨DF的早期发现及防治，现报告如下。endprint

1 资料与方法

1.1 一般资料 2014年2月-2015年12月选择在本院就诊的T2DM患者，根据DF（Wagner分级）[7]标准：并发有严重的周围神经病变、自主神经病变和周围血管病变，伴或不伴开放性损伤的DF。使用DF诊断箱选取并发DF患者40例，年龄36～82岁，病程4～21年；选择无慢性并发症患者30例为DM对照组，另外选择门诊体检结果正常人员48例为健康对照组，所有对象常规检查糖化血红蛋白（HbA1c）、血脂、ApoE基因多态性及oxLDL。

1.2 方法

1.2.1 DF诊断箱 （1）采用8 MHz双向多普勒仪检查，同时配合踝肱及趾肱血压组件（测量踝肱指数ABI，趾肱指数TBI），检查外周血管的硬化、狭窄及阻塞状况；（2）采用10 g尼龙丝触觉检查和局部针刺疼痛觉检查，采用神经病变定量音叉、多功能叩诊锤、凉温觉检查器、数字震动感觉阈值检查仪检查温度和震动感觉阈，诊断多发性外围感觉神经病变。

1.2.2 血液标本采集及检测 所有研究对象均于空腹12 h采集静脉血6 mL，4 mL进行临床指标的检测，2 mL置于-70 ℃低温冰箱备检基因型；ApoE基因型测定：采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性方法（PCR-RFLP）检测，具体方法：按常规方法提取DNA并进行PCR扩增，上游引物：5-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACA-3，下游引物：5-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3，由珠海赛乐奇生物技术有限公司设计并合成。PCR循环条件采用Touch Down程序：（1）94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共12个循环；（2）94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共20个循环。PCR产物经特异性限制性内切酶Hhal消化后，经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳6～8 h，溴化乙锭染色0.5 h后，出现4种ApoE基因型：ε2/3、ε2/4、ε3/3、ε3/4；oxLDL采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定，试剂盒由上海荣盛生物技术公司生产；HbA1c采用乳胶免疫抑制凝集法测定；血糖、血脂采用酶法由全自动生化分析仪（日立7600）测定。

1.3 统计学处理 利用Stata 10.0软件包对数据进行处理，计数资料采用 字2检验或精确概率法，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，组间进行方差分析（ANOVA），然后应用S-N-K方法进行组间两两比较，采用Logisitic回归进行相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ApoE基因多态性检测结果 运用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法，共检出ApoE4种常见基因型ε2/3、ε2/4、ε3/3、ε3/4；三种等位基因ε2、ε3和ε4。基因型以ε3/3最常见（61.0%），其次ε2/3（21.2%）、ε3/4（16.1%），ε2/4最少见（1.7%）；等位基因以ε3最常见（79.7%），其次ε2（11.4%），ε4最少见（8.9%）。

2.2 各组基因型和等位基因频率比较 ApoEε3/3、ε3/4基因型和ε4等位基因频率三组比较差异均有统计学意义（P

2.3 不同基因型和等位基因之间临床指标比较 各基因型之间比较：ε2/4、ε3/4 TCH、LDL、oxLDL、HbA1c均明显高于其他两者，HDL低于其他两者；各等位基因之间比较：ε4 TCH、LDL、oxLDL、HbA1c均显著高于ε2、ε3，而HDL则明显低于ε2、ε3，ε2 TG则明显高于ε3、ε4，见表2。

2.4 DF与ApoE基因多态性的相关分析 以DF发生为因变量，选择ApoE基因型或等位基因自变量作Logistic回归，ApoEε3/4基因型[ 字2=8.25，P<0.05，95%CI（0.062～0.723）]和ε4[ 字2=6.02，P<0.05，95%CI（0.952～24.996）]与DF明显相关。

3 讨论

DF是指DM患者足部由于神经病变使下肢保护功能减退，大血管和微血管病变使动脉灌注不足致微循环障碍而发生溃疡和坏疽的疾病状态。DF是DM一种严重的慢性并发症，是DM患者致残致死的重要原因之一。DF之所以治疗效果不理想、预后较差，一方面是由于它的发病机制涉及遗传因素、环境因素、高血糖等多种致病因子，病理生理变化及临床表现与其他动脉硬化闭塞性肢体疾病相比更为复杂，部分发病机制尚未完全明了[8]，另一个主要原因是没有一种比较理想的检测方法能够早期准确的预测并给予相应早期处理。因此探讨高危DF（DF-Wagner分级0级）的早期识别手段对于DF的预后具有重要意义。

人类ApoE基因具有显著的遗传多态性，ApoE基因的多态性已被证实是心血管病如冠心病的易患因素[9]。ApoE的重要生理功能是作为脂蛋白的配体与功能蛋白，参与脂质的肝脏代谢，尤其是致AS脂类如乳糜微粒残基的代谢，从而影响冠心病的发病。

ApoE有3种等位基因ε2、ε3、ε4，构成常见的6种表型：即3种纯合子（ε2/2、ε3/3、ε4/4）和3种杂合子（ε2/3、ε2/4、ε3/4），其中以ε3/3、ε2/3、ε3/4频率为最高，ε2/2、ε2/4、ε4/4较少见。本研究ε3/3、ε3/4检出率最高，未检出ε2/2、ε4/4基因型，与张东平等报道基本相符[10-11]。

本研究结果显示：携带ε4等位基因的ε2/4、ε3/4 TCH、LDL、oxLDL、HbA1c均明显高于ε2/3、ε3/3，HDL低于上述两者，等位基因ε2 TG明显高于ε3、ε4，与既往文献[12-13]资料基本吻合，提示ApoE基因多态性与血脂代谢、脂质氧化密切相关，ε4似有升高致AS胆固醇、促进脂质氧化作用，这与文献[14-15]报道一致。ApoE基因多态性影响脂质代谢的机制比较复杂，其可能的机制为：（1）ApoE是LDL受体的配体，其主要功能是与肝细胞上LDL受体结合，使肝细胞吞噬脂蛋白并代謝內部的胆固醇，进而影响血脂代谢，由于APOE表型不同，与LDL受体结合的能力也不同，ε4与LDL受体结合活性明显高于ε2，与ε3相似，机体可通过肝细胞ApoE受体吞噬较多的含ε4脂蛋白，使肝细胞游离胆固醇含量增加，引起肝细胞表面的LDL受体继发性表达下调，从而导致LDL增加[16-17]；（2）ε4携带者小肠吸收胆固醇增加，因而血浆LDL水平较高[18]；（3）ε4等位基因与突变的LDL受体基因连锁，导致外周组织LDL受体转录的下调，减慢LDL分解，从而提高血浆LDL水平[19]；（4）ε4诱导巨噬细胞功能障碍、细胞凋亡、线粒体异常并且促进炎症反应[20]。

本研究结果显示：DF组ε3/4基因型和ε4等位基因均高于DM对照组及健康对照组（P<0.05），而ε3/3基因型则低于其他两组，Logistic回归分析ApoEε3/4基因型和ε4与DF明显相关（P<0.05），提示ApoEε3/4基因型和携带ε4等位基因的T2DM患者发生DF的危险性较其他基因型及携带其它等位基因的T2DM患者为高，ε4可能是T2DM患者并发DF的危险因子，其机制可能与上述影响脂质代谢作用有关。

本研究表明，ApoE基因多态性确实影响机体的血脂、脂蛋白及脂质过氧化水平，ε4等位基因以及携带ε4的ε2/4、ε3/4基因型与高TCH、LDL、氧化应激及DF的发生存在明显关联，这对于DF的早期识别及防治具有一定的指导意义。

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（收稿日期：2017-06-05） （本文編辑：程旭然）endprint