青娥方对去卵巢大鼠血清MMP-9、TRACP5b、Cath-K及骨组织形态结构的影响

王柄棋，罗文娟，孙雨晴，陈 翔，林燕萍

（福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122）

绝经后骨质疏松症主要是由于绝经后妇女体内雌激素水平下降，骨重建失偶联，骨吸收大于骨形成所致，属于高转换型骨质疏松症，其中破骨细胞骨吸收增强是其发病的主要机制之一。基质金属蛋白酶-9（matrix metalloprotrinse 9，MMP-9）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tatrate-resistant acid phosphatase，TRACP）、组织蛋白酶 K（cathepsink，Cath-K）是骨吸收过程中重要的骨基质降解酶，脱氧吡啶啉（deoxypyridinoline，DPD）是骨I型胶原的降解产物。以上3种酶及尿DPD都是骨吸收的特异性生化指标，能客观、特异、准确反映破骨细胞的功能活性，显示骨组织代谢中的骨吸收状况。本研究通过动物实验观察补肾传统良方青娥方对去卵巢大鼠血清中 MMP-9、TRACP5b、Cath-K 含量和尿液 DPD／Cr的影响，结合骨组织形态结构改变，进一步探讨青娥方的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 120只3月龄SPF级雌性SD大鼠，体质量（305±15）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2012-0002；由福建中医药大学实验动物中心SPF级动物房饲养，许可证号：SYXK（闽）2014-0001。

1.2 实验药物 青娥方药物组成：杜仲（盐炒）480 g，补骨脂（盐炒）240 g，核桃仁（炒）150 g，大蒜 120 g。购自福建省国医堂，由福建中医药大学求真楼中药平台加工成浸膏，每克浸膏含生药5.79 g。骨疏康颗粒购自辽宁康辰药业有限公司。

1.3 实验试剂 TRACP、MMP-9、Cath-K、DPD ELISA试剂盒（上海西塘生物技术有限公司）；肌酐检测试剂盒（南京建成生物研究所）；乙二胺四乙酸二钠（上海博亚生物技术公司）。

1.4 实验仪器 酶标仪（美国Hologic公司，ELx 800）；切片机（德国 LEICA 公司，RM2135）；超低温－80℃冰箱（日本SANYO公司，MDF-382E）；生物组织自动包埋机（湖北泰维医疗科技有限责任公司，TB-718E）；电动离心机（金坛市恒丰仪器厂，YJ80-2）；光学显微镜（日本OLYMPUS光学工业株式会社）。

2 实验方法

2.1 造模和干预 120只大鼠在动物房适应性饲养1周后，用随机数字表法按1∶2的比例分为假手术组和卵巢摘除组。卵巢摘除组行双侧卵巢摘除术，将大鼠仰卧位固定，取腹部正中切口，钝性分离暴露腹腔，找出双侧卵巢，完全结扎并切除，术后肌肉注射青霉素（每次8万单位／d），连续注射3 d。假手术组也取腹部正中切口但不切除双侧卵巢，其余步骤同卵巢摘除组。术后卵巢摘除组再用随机数字表法按1∶1∶1的比例分为生理盐水组、青娥方组和骨疏康组。实验大鼠均于术后第3天开始药物干预。给药剂量根据人和动物间体表面积折算的等效剂量比值表计算，并根据大鼠体质量变化实时调整给药剂量。青娥方组按3.6 g／（kg·d）的剂量灌服青娥方生药，骨疏康组按 1.8 g／（kg·d）的剂量灌服骨疏康颗粒，假手术组、生理盐水组每天予灌服生理盐水2 mL／只。各组分别于干预4、8、12周时分批处死取材。

2.2 取材 取材前1天，将各组大鼠按1只／笼置于代谢笼中，予禁食不禁水处理，收集24 h尿液，离心取上清液，分装后储存于－80℃冰箱；腹主动脉取血，充分静置，2 000 r／min，离心 20 min，分装后置于－80℃冰箱冻存；分离大鼠左侧胫骨上段，固定后脱钙。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 血清生化指标及尿DPD含量检测 从－80℃冰箱中各取出1份分装好的血清和尿液样品，室温下平衡30 min，确定酶标板中的上样孔数。参照ELISA试剂盒说明书，在波长450 nm处读取A值，并根据A值绘制标准曲线，计算样本血清MMP-9、TRACP5b、Cath-K及尿DPD的含量。

2.3.2 尿肌酐检测 －80℃冰箱取出1份尿液，用纯水按1∶200比例稀释，参考肌酐生化试剂盒说明书，以波长510 nm检测各管吸光值，并计算DPD／Cr比值。

2.3.3 骨组织HE染色及骨小梁面积百分比 分离大鼠左胫骨上段，将周围软组织剃净，多聚甲醛固定，10%EDTA／PBS（pH7.4）脱钙，石蜡包埋切片，HE染色后镜下观察胫骨干骺端的形态结构。应用数码医学图像分析系统（Motic Med 6.0），测定骨小梁面积百分比（Tb.Ar%）。

骨小梁面积百分比（Tb.Ar%）＝视野测量框内骨小梁的面积（Tb.Ar） ／测量框总面积（T.Ar）×100%

2.4 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理，计量资料符合正态分布以（）表示，采用单因素方差分析。

3 结果

卵巢摘除过程中，因腹腔出血等原因死亡的大鼠共7只，其中干预4周假手术组、生理盐水组、青娥方组、骨疏康组和干预8周生理盐水组、青娥方组、骨疏康组每组各1只，共取材113只。

3.1 4组不同干预时间血清 MMP-9、TRACP5b、Cath-K变化比较 见图1～图3。

3.2 4组不同干预时间尿DPD／Cr比较 见图4。

3.3 骨组织形态学变化情况 卵巢摘除后，3个时间点假手术组骨小梁形态大致相同，骨小梁分布均匀，排列规则，交织呈网状。生理盐水组骨小梁改变明显，出现不同程度的变细、变形，呈碎片、断裂现象。青娥方组和骨疏康组骨小梁完整性不及同期假手术组，但骨小梁数目、排列以及结构完整性均优于同期生理盐水组。骨小梁面积百分比检测结果与光镜下所见基本一致。见图5、图6。

图1 4组不同干预时间血清MMP-9含量比较

图2 4组不同干预时间血清TRACP5b含量比较

图3 4组不同干预时间血清Cath-K含量比较

图4 4组不同干预时间尿DPD／Cr含量比较

图5 4组大鼠干预12周后骨组织HE染色图（×50）

4 讨论

骨骼塑造完成后，随着年龄的增长，生物力学环境发生改变，骨骼通过不断的老骨移除和新骨替换来维持骨的正常功能。“活化—吸收—形成”是骨重建过程的特点，在所有骨重建表面，都要经过骨吸收、骨形成及静止几个阶段［1］。破骨细胞在骨重建中有着启动作用，其骨吸收功能的发挥首先需要向骨基质迁移、粘附，然后破骨细胞极化，使皱褶缘、封闭区与骨基质表面形成一个密闭的空间，构成骨吸收装置，在富含H＋及相关降解酶的环境下溶解骨质［2］。骨基质的降解产物由细胞内吞并经跨胞浆转运空泡，从皱褶缘运送到功能性分泌结构域，进而释放到细胞外环境，被血液运输到肾脏，经肾小球滤过随尿液排出体外。

图6 用药后不同时间各组Tb.Ar%比较

MMP-9在破骨细胞中特异性高表达，主要降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅹ型胶原。研究发现随着绝经后妇女血清MMP-9水平的升高，骨基质降解，骨密度逐渐降低［3-7］。 Bolton 等［5］认为 MMP-9 在骨吸收过程中发挥着重要的作用，其实验研究显示血清中MMP-9浓度与BMD值呈负相关，证实了他的观点。TRACP5b是TRACP的同工酶，特异性高表达于破骨细胞，也是血中TRACP5b的主要来源［6］，并在一定程度上反映了破骨细胞的功能活性［8-9］。Cath-K在静止的破骨细胞中主要以不活跃的Cath-K前体形式存在，Cath-K前体是一条未糖基化的多肽单链，在酸性环境下可转换为具有活性的Cath-K［10］。Cath-K在破骨细胞中显著表达，能降解骨基质中的Ⅰ型胶原蛋白、骨桥接素和骨连接素，是骨吸收过程中的一个关键酶［11-14］。本实验结果显示卵巢切除后，3个时间点的生理盐水组血清MMP-9、TRACP5b、Cath-K的含量均高于同期假手术组（P＜0.01，P＜0.05），表明卵巢切除后，随着雌激素水平的下降，血清中骨基质降解酶的含量逐渐升高，骨吸收增强。干预后青娥方组血清MMP-9、TRACP5b、Cath-K的含量均低于同期生理盐水组（P＜0.01，P＜0.05），说明青娥方能够降低血清中骨基质降解酶的含量，进而抑制破骨细胞对骨基质的降解。

DPD是骨胶原纤维的代谢产物，仅存于骨和牙的Ⅰ型胶原纤维中，而后者含量甚微，故尿液中DPD几乎来源于骨骼，能准确反应骨胶原纤维的分解代谢［15-16］。本实验结果发现生理盐水组尿DPD／Cr比值均高于同期假手术组（P＜0.01，P＜0.05），提示卵巢切除后，破骨细胞对骨Ⅰ型胶原的降解作用加强；而青娥方组尿DPD／Cr比值均低于同期生理盐水组（P＜0.01，P＜0.05），表明青娥方能够降低破骨细胞的功能活性，抑制其对骨Ⅰ型胶原的降解。同时，骨组织形态结果显示生理盐水组骨小梁数目、排列以及结构完整性明显不及同期假手术组，Tb.Ar%在8、12周均明显低于同期假手术组（P＜0.01，P＜0.05），提示卵巢切除后，骨吸收增强，骨组织形态遭到破坏；青娥方组骨小梁数目、排列以及结构完整性均优于同期生理盐水组，Tb.Ar%在8、12周均明显高于同期生理盐水组（P＜0.05），进一步说明青娥方能有效地抑制破骨细胞骨吸收功能，减少对骨基质的吸收破坏，发挥护骨的作用。

综上所述，中药青娥方可以通过降低血清MMP-9、TRACP5b、Cath-K的含量，来抑制破骨细胞的功能活性，减少对骨基质的吸收破坏，最终发挥护骨强骨之功。

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