联合监测血清AFP-L3与HBV DNA在诊断肝硬化癌变中的价值

王瑜，王志军

（1.河南科技大学附属安阳市第五人民医院 检验科，河南 安阳 455001；2.河南省安阳市人民医院 普外科，河南 安阳 455000）

乙 型 肝 炎 病 毒（hepatitis B virus，HBV） 的复制与乙型肝炎肝硬化癌变关系密切；甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）是一种糖蛋白，依据对小扁豆凝集素（lens culinaris agglutinin，LCA）亲和电泳的反应性，AFP可以被分为3种异质体：L1、L2及L3，AFP-L3与小扁豆凝集素高亲和力，仅由肿瘤细胞产生。为了解乙型肝炎肝硬化癌变患者HBV复制状况以及AFP-L3的表达情况及其诊断价值，本研究对66例乙型肝炎肝硬化癌变和71例乙型肝炎肝硬化患者的血清HBV DNA及AFP-L3进行了联合检测，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2013年10月-2015年8月在安阳市第五人民医院就诊资料完整的门诊及住院患者，其中66例乙型肝炎肝硬化癌变（肝硬化癌变组）和71例乙型肝炎肝硬化（肝硬化组）。肝硬化癌变组均经临床、影像及病理学确诊，原发性肝癌的诊断标准参照中华人民共和国卫生部颁发的2011年版《原发性肝癌诊疗规范》[1]，其中，男39例，女27例；年龄33～76岁（中位数55岁）；均有乙型肝炎肝硬化病史8～26年（中位数19年）。肝硬化组中，男53例，女18例；年龄20～76岁（中位数49岁）；病程6～21年（中位数13年）；诊断标准符合2000年全国传染病与寄生虫病学术会议诊断标准[2]。经统计学分析显示，两组之间在性别、年龄、乙型肝炎肝硬化病史等方面差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 试剂及仪器

AFP-L3和总AFP检测采用化学发光免疫分析法，所用Maglumi 2000 plus全自动化学发光测定仪及配套试剂购自深圳市新产业生物工程股份有限公司，AFP-L3亲和吸附离心管购自北京热景生物技术有限公司。HBV DNA定量测定采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）进行检测，检测试剂盒由厦门安普利生物工程有限公司提供，使用美国AMI公司生物PE2400扩增仪。

1.3 操作方法

1.3.1 HBV DNA定量测定 ①提取核酸：血清标本50μl加入等量提取液并震荡混匀，吸取前吹打以便吸取固体沉淀颗粒物；瞬时离心后，100℃金属浴10 min，12 000 r/min离心10 min，留取上清液。②qRT-PCR检测：配制PCR反应液（35.6μl HBV反应混合液+0.4μl Taq 酶），每管分别加入2μl待测样本、阳性对照和阴性对照，混匀后瞬时离心，置入qRT-PCR仪中，以95℃ 3 min、94℃ 15 s、60℃ 30 s进行40个循环的扩增，收集FAM、HEX通道荧光信号，记录检测结果。HBV DNA＞5.00+2Ecopies/ml为阳性。

1.3.2 AFP-L3分离 首先取患者血清400μl加入600μl清洗液中混匀。亲和吸附离心管的上部离心管置入离心外管，以3 000 r/min离心20 s去除保护液，吸取稀释后的血清600μl加入上部离心管中，室温下放置10 min；加入清洗液1.2 ml，也以3 000 r/min离心20 s，丢弃上清液。而后加入600μl洗脱液，同样3 000 r/min离心20 s，收集离心柱外管中的液体，即为含AFP-L3的样本；用电化学发光法检测总的AFP和AFP-L3的含量，计算AFP-L3占AFP总量的百分比。以2005年美国FDA设定的AFP-L3/AFP＞10%作为阳性判断标准。

1.4 统计学方法

采用SPSS19.0软件进行统计分析，AFP-L3及HBV DNA阳性率采用χ2检验。AFP-L3及HBV DNA的一致性检验采用Kappa评价，判断标准为Kappa值≤0.40，说明一致性较差；0.40＜Kappa值＜0.75，说明一致性一般；Kappa值≥0.75，说明有较好的一致性。敏感性=真阳性人数/（真阳性人数+假阳性人数）×100%；特异性=真阴性人数/（真阴性人数+假阴性人数）×100%。

2 结果

2.1 两组AFP-L3及HBV DNA阳性率比较

两组血清AFP-L3阳性率分别为74.2%（49/66）和9.9%（7/71），两组比较，差异有统计学意义（χ2=58.667，P=0.000），肝硬化癌变组高于肝硬化组；两组血清HBV DNA阳性率分别为59.1%（39/66）和33.8%（24/71），两组比较，差异有统计学意义（χ2=8.806，P=0.003），肝硬化癌变组高于肝硬化组。

2.2 两组血清AFP-L3及HBV DNA结果的一致性比较

两组AFP-L3与HBV DNA结果总符合率为87.6%（120/137）；两组结果的一致性检验采用Kappa评价，Kappa=0.748，说明2种方法吻合程度一般。见表1。

表1 血清AFP-L3及HBV DNA的一致性比较 例

2.3 血清AFP-L3及HBV DNA联合检测对肝硬化癌变诊断的效能比较

AFP-L3与HBV DNA并联诊断肝硬化癌变的敏感性与单独检测AFP-L3比较，差异有统计学意义（χ2=6.371，P=0.012），并联诊断高于单独检测；两者串联诊断肝硬化癌变的特异性与单独AFP-L3检测比较，差异无统计学意义（χ2=0.132，P=0.716）。见表2。

表2 血清AFP-L3及HBV DNA单独/联合检测对肝硬化癌变诊断的效能比较 %

3 讨论

AFP是一种肿瘤相关的糖蛋白，依据对LCA亲和电泳的反应性，AFP可以被分为3种异质体：L1、L2及L3，AFP-L1不与LCA反应存在于慢性肝炎和肝硬化中，构成非恶性肝病中总AFP的主要部分；AFP-L2与LCA有中度亲和力，主要来源于卵黄囊肿瘤，在怀孕期间在母体的血清中也可以检测到[2]；AFP-L3与LCA高亲和力结合，它是一种异常糖基化的AFP，仅由肿瘤细胞产生，近年来被FDA批准用于原发性肝癌的临床辅助诊断，第四届全国肝癌学术会议也将AFP-L3定为原发性肝癌的诊断标记物之一。

本研究表明，肝硬化癌变组AFP-L3的阳性率高于肝硬化组，两组之间差异有统计学意义。JIA等[3]的研究发现，肝癌患者AFP-L3阳性率为75.5%（77/102）与本组结果基本相符。多项研究表明[4-6]，即使AFP水平较低的患者，AFP-L3也有较高的表达，AFP-L3对于AFP阴性的早期肝癌也是良好的标记物。AFP-L3具有较高的特异性，可用于肝癌患者术后的随访。AFP-L3如果术后不能转阴，往往提示预后不良[7-8]。

HBV感染是HCC发生的危险因素之一，HBV DNA高复制状态常被认为是发生HCC的高危因素。多因素分析表明，乙型肝炎肝硬化患者HBV DNA阳性是肝癌发生的危险因素[9]。一项长达14年的关于乙型肝炎病毒载量与肝癌发病风险的前瞻性研究发现[10]，HBV DNA是启动肝癌重要的预警因子，癌变患者HBV DNA阳性率达80.5%（70/87）。也有研究表明[11]HBV DNA的载量越高发生肝癌的危险性越高。本组中癌变患者HBV DNA阳性率也高于肝硬化患者。

AFP-L3及HBV DNA检验结果具有一定程度的一致性（Kappa值=0.748，虽没有达到0.75，但也十分接近），说明两者有一定的关联，均可以作为乙型肝炎肝硬化癌变的重要标志物。本研究表明，AFP-L3及HBV DNA并联检测的敏感性高于单独检测AFP-L3及HBV DNA，2指标并联检测敏感性的升高，能有效地避免部分AFP-L3阴性或HBV DNA阴性患者的漏诊，用于原发性肝癌的早期筛查具有很高的临床应用价值。与单独检测AFP-L3相比，两者的串联检测的特异性没有明显提高，说明单独检测AFP-L3对于乙型肝炎肝硬化癌变患者诊断有较高的准确率。

AFP-L3及HBV DNA检验结果具有一定程度的一致性，均可以作为乙型肝炎肝硬化癌变的重要标志物。AFP-L3及HBV DNA并联检测能够提高诊断乙型肝炎肝硬化癌变敏感性，可以有效地减少癌变患者的漏诊。

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