FGF-1对TGF-β1诱导的H9c2心肌细胞凋亡与Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9表达的关系研究*

李厚忠，郭金兴，张胜强，张羽飞

（1.牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011；2.牡丹江医学院附属红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011）

酸性成纤维细胞生长因子（acidic fibroblast growth factor，FGF-1）是一种广泛存在于人体各组织中的具有多方面功能的生物活性蛋白，其在组织形态的发生、发展，血管生成以及创伤愈合等诸多方面发挥着十分重要的作用[1]。同时，FGF-1也是成纤维细胞、血管内皮细胞、角膜细胞、心肌细胞、星形胶质细胞及神经细胞等生长的刺激因子[2]。研究表明[3]，FGF-1可缓解心肌短暂缺血引起的心肌梗死和心律失常等临床症状。也有研究表明[4]，对于由缺血造成心肌的损伤（缺血-再灌注损伤），FGF-1可通过增加血管生成发挥心肌保护作用。但是，有关于FGF-1是否具有抗心肌细胞凋亡作用，国内外鲜见报道。本研究采用体外培养心肌H9c2细胞，建立转化生长因子 -β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1） 诱导的H9c2细胞凋亡模型，观察FGF-1对H9c2细胞存活率，凋亡指数以及凋亡相关酶半胱氨酸蛋白 酶 -3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3），半胱氨酸蛋白酶-8（cysteinyl aspartate specific proteinase-8，Caspase-8）和半胱氨酸蛋白酶-9（cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase-9）表达的影响，探讨FGF-1抗H9c2细胞凋亡作用及可能的作用机制，为其进一步研究开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

心肌细胞株H9c2（中科院上海细胞研究所细胞库），FGF-1（美国R&D system公司），肝素（Heparin，美国 Sigma公司），TGF-β1（美国 PEPROTECH 公司），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT，美国Amresco公司），DMEM培养液和胎牛血清（美国Gibco公司），TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（南京凯基生物有限公司），DAPI（上海碧云天公司），兔抗人caspase-3单克隆抗体、兔抗人caspase-8单克隆抗体和兔抗人caspase-9单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），HRP标记抗鼠IgG二抗（上海碧云天公司），其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 H9c2细胞培养在DMEM培养基（含10%胎牛血清、200 mmol/L L-谷氨酰胺、100μg/ml硫酸链霉素、100 u/ml青霉素钠）中，37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养3～5 d，待细胞达80%汇合度时，传代。收集对数生长期细胞，制成单细胞悬液用于进一步实验。

1.2.2 MTT比色分析检测H9c2细胞存活率 取对数生长期H9c2细胞，调节细胞密度为1×105个细胞/ml细胞悬液，接种于96孔板中，每孔200μl，37℃、5%CO2及饱和湿度下培养。待细胞贴壁后弃上清，参照文献[5]及预实验结果，TGF-β1模型组每孔加入DMEM培养基，Heparin组每孔加入100μg/ml Heparin，FGF-1组每孔加入20 ng/ml FGF-1，FGF-1/Heparin组每孔加入20 ng/ml FGF-1和100μg/ml Heparin，正常对照组每孔加入DMEM培养基，每组设6个平行孔。37℃、5%CO2及饱和湿度下分别培养12 h，弃上清。正常对照组每孔加入DMEM培养基，其余各组均每孔加入20 ng/ml TGF-β1，继续培养12 h后，各组每孔加入MTT溶液（0.5 mg/ml）20μl，37℃、5% CO2及饱和湿度下继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入DMSO 150μl，振荡10 min。Rayto RT-6100酶标仪于490 nm波长处测定A值。计算细胞存活率。存活率（%）=（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%，取6孔平均值。

1.2.3 TUNEL染色检测H9c2细胞凋亡 使用TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒检测FGF-1对TGF-β1诱导的H9c2细胞凋亡的影响。给药及分组方法同“1.2.2”，PBS冲洗2次，每次 3 min，然后-20℃甲醇固定15 min。PBS冲洗3次，每次3 min，加入50μl TUNEL反应液，避光37℃孵育1 h。PBS冲洗2次，每次3 min，Hoechst 33258染料37℃避光染色10 min。Olympus BX43荧光显微镜观察细胞核的形态。每个图片随机选取6个高倍视野，计算凋亡指数（apoptotic index，AI），AI（%）=TUNEL阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.2.4 Western blot检测 给药及分组方法同“1.2.2”，加入含有25 mmol/L HEPES、1% Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L EGTA、1 mmol/L PMSF和1μg/ml亮肽素的冰冷的裂解缓冲液（pH=7.4），10 000 r/min 4℃离心10 min，弃沉渣，收集上清液，BCA法测定总蛋白浓度。取30μg蛋白上样后进行10%SDS-PAGE凝胶电泳。当电泳完成后，电转至0.45μm PVDF膜上，5%脱脂奶粉PBST 4℃封闭2 h。然后加入兔抗人caspase-3单克隆抗体，兔抗人caspase-8单克隆抗体，兔抗人caspase-9单克隆抗体（1∶1 000稀释）4℃孵育过夜。PBST洗涤后，加入生物素标记的山羊抗兔第二抗体（1∶500稀释）室温孵育2 h。PBST洗涤3次，每次5 min，ECL化学发光试剂显色，Bio-Rad凝胶成像系统对各组条带进行计值及统计学分析。β-actin抗体孵育方法与上述方法相同，蛋白的相对表达水平=目标蛋白表达水平/β-actin蛋白表达水平。每份样品检测6次。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较，采用单因素方差分析，组间两两比较，采用SNK法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FGF-1对TGF-β1诱导的H9c2细胞存活率的影响

MTT比色分析结果显示，模型组H9c2细胞存活率降低，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；FGF-1组 和 FGF-1/Heparin组 H9c2细胞存活率升高，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。以上结果表明，FGF-1对TGF-β1诱导的H9c2细胞损伤具有保护作用。见图1。

2.2 FGF-1对TGF-β1诱导的H9c2细胞凋亡的影响

TUNEL染色结果显示，模型组H9c2细胞凋亡指数升高，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；FGF-1组 和 FGF-1/Heparin组 H9c2细胞凋亡指数降低，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。以上结果表明，FGF-1对TGF-β1诱导的H9c2细胞凋亡具有抑制作用。见图2。

2.3 FGF-1对TGF-β1诱 导 的H9c2细 胞Caspase-3、Caspase-8和 Caspase-9表达 的影响

Western blot结果显示，模型组H9c2细胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表达升高，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；FGF-1组和FGF-1/Heparin组H9c2细胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表达降低，与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。以上结果表明，FGF-1对TGF-β1诱导的H9c2细胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表达具有抑制作用。见图3。

图1 FGF-1对TGF-β1诱导的H9c2细胞存活率的影响

图2 FGF-1对TGF-β1诱导的H9c2细胞调亡的影响

图3 FGF-1对TGF-β1诱导的H9c2细胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表达的影响

3 讨论

FGF是一类多肽类物质，其中大多数成员可与肝素结合发挥作用，单独作用对细胞效果一般。因此，一般使用肝素与FGF-1一起作用，提高FGF-1的药效[6]。本研究结果发现，FGF-1可提高H9c2细胞的存活率，FGF-1对H9c2细胞具有明显的保护作用。

细胞凋亡是指发生在生理状态下的细胞程序性死亡，其特点是不发生炎症反应。本研究TUNEL染色发现，FGF-1对TGF-β1诱导的H9c2细胞凋亡具有抑制作用。细胞凋亡受分子水平的调控[7]，为探讨FGF-1对TGF-β1诱导的H9c2细胞抗凋亡的可能机制，本研究对Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9进行了检测。Caspases是在细胞凋亡中起关键作用的酶家族，是细胞凋亡的介导者和执行者，激活或超量表达均会引起细胞凋亡，又称凋亡蛋白酶，对凋亡起关键作用[8]。有研究表明[9]，细胞的凋亡是由于Caspase逐步发生级联反应引起的。Caspase-3位于Caspases级联反应的下游，被认为是诱导细胞凋亡真正的实施者[10]。经典的细胞凋亡途径分为2条，包括细胞外途径和细胞内凋亡途径[11]。在细胞外途径过程中，死亡配体和相对应的受体结合形成死亡信号，接着再与信号传导分子相连接，进一步和Caspase-8结合，形成死亡诱导信号复合物，从而使Caspase-8活化，当Caspase-8直接与Caspase-3发生作用，Caspase-3被激活，进而诱导细胞凋亡[12]。而细胞内途径也称为线粒体途径，在此途径中，凋亡刺激因子与凋亡蛋白酶激活因子1（apoptotic protease activating factor 1，APAF1）形成多聚复合物，然后胞质中的Caspase-9前体结合，形成巨大复合物，巨大复合物引起Caspase-9前体活化，Caspase-9再激活下游的Caspase-3，从而发生级联反应，最后诱导细胞凋亡[13]。心肌细胞的凋亡作用可能是非缺血和/或缺血性心肌病患者心肌细胞死亡的一种形式。一旦心肌细胞发生凋亡，原有的心肌即被胶原纤维所取代，继而心肌就会进一步发生纤维化、肥厚、心室重构等，最终发展至心力衰竭[14]。因此，有关于心肌细胞的凋亡作用及机制越来越受到国内外学者的广泛重视。研究表明，TGF-β1是在HF过程中急剧增加的细胞因子中的一员，心肌细胞在TGF-β1的刺激下可发生细胞凋亡，TGF-β1作为导致心肌纤维化诸多因素最后的共同中介之一，被认为是影响心肌纤维化最直接，也是最重要的细胞因子[15]。本研究Western blot结果显示，FGF-1对TGF-β1诱导的H9c2细胞Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表达也具有抑制作用。以上结果提示，FGF-1可能通过抑制Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表达从而对TGF-β1诱导的H9c2心肌细胞具有抗凋亡作用。

终 上 所 述，FGF-1对TGF-β1诱 导 的H9c2心肌细胞凋亡具有抑制作用，其机制可能与抑制Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表达有关。

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