意大利猪圆环病毒3型的检测及遗传特征分析

摘译自 S． Faccini等， Transbound Emerg Dis．2017：1-4．咸 文，梁海英，曾智勇

（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

荐语：圆环病毒3型（PCV3）是具有猪皮炎肾病综合征和繁殖障碍的临床样品中鉴定出的一种新型圆环病毒，意大利研究者通过qPCR技术对样品中PCV3进行筛选并对其基因序列做出分析，使之成为第一个报告PCV3的欧洲国家。为帮助养猪从业者更好地了解PCV3的相关信息，特对目前仅有的几篇PCV3相关研究文献进行摘译以飨读者，并期待能有越来越多的相关研究来尽快揭示PCV3流行病学信息及遗传特征，为国内对该病毒的研究奠定一定基础。

曾智勇，男，1978年9月生，四川威远人，博士，贵州大学教授、硕士研究生导师、贵州大学学术骨干，贵州省科技特派员，黑龙江畜牧兽医杂志编委。主要从事动物传染病及病原分子生物学相关研究，以规模化猪场主要病毒性疫病为基础，开展新型疫苗和病原快速检测方法及试剂盒的研发。同时，长期面向猪场开展猪病毒性疫病的抗体监测和病原的快速检测以及规模化猪场疾病防控指导，为猪场提供技术支持。

猪圆环病毒3型 (PCV3) 是一种新型猪圆环病毒，已经被美国和中国的研究人员先后报道。现有报道表明PCV3与猪皮炎肾病综合征，繁殖障碍及和全身炎症性疾病有关。文内报道了PCV3在意大利的发生情况。PCV3在位于其波河流域的两个农场的猪胎儿和死产仔猪的组织中被检测到，两株意大利PCV3毒株的基因组与GenBank中其他毒株的序列相似性度为97．8%～99．7%，该研究进一步加强了PCV3作为一种新兴的猪圆环病毒，在世界范围内普遍存在的推测。为此，加强该病毒相关流行病学及致病性的研究，显得尤为急迫。

本研究参考2016年Palinski等人报道的方法，将经PBS（0．1M， pH7．4）10倍 稀 释 的 临 床组织匀浆样品后，使用One-For-All Vet Kit（Qiagen）提取核酸，以含有PCV3-US/SD2016 (KX966193) 毒株第1 392～1 575位人工合成核苷酸序列的重组质粒为阳性对照，通过实时PCR（qPCR）对临床样品进行PCV3感染情况的筛查。同时，也对这些临床样品分别进行PRRSV、PCV2、PPV1、PPV2、PPV4、PRV的病原检测。对于PCV3 qPCR阳性的样品，参考2016年Palinski等人报道的方法，就病毒cap基因约330 bp大小的片段进行PCR扩增和测序以求进一步确证；而后，参照该文献方法，进一步扩增获得PCV3的全基因序列，并应用相关分子生物学软件进行病毒基因组遗传特征的分析。

所有PCV3待查样品系2017年3-4月期间送至曼托瓦IZSLER实验室进行繁殖障碍病原检测的临床组织样品，共来自9个养殖场。其中7个养殖场位于曼托瓦省，2个位于波河流域的不同省。通过qPCR检测，共筛查出16份猪流产胎儿和死胎样品中存在PCV3。死胎肺脏组织中的病毒载量较高，每微升DNA提取物中约为1×107个基因组拷贝（相当于1 g组织样品中基因组拷贝为 1×1011）。2017年 3月初，第一个被确诊为PCV3阳性的样品，来自科摩省的一个小型有机农场，该场有8头母猪，几周来持续发生繁殖障碍。同年3月底，第二个被确诊的样品系3只死胎的混合组织样品，来源于曼托瓦省的一个养殖场（其距科摩省相关农场134 km），其有较高的病毒载量，每微升DNA提取物中约为1×106个基因组拷贝；在死胎的脑，肺，胸腺和心脏的组织样品中，均可检测到PCV3的存在，其中脑组织样品中的病毒载量为1×109拷贝/g，胸腺中为1×1010拷贝/g。PCV3检测为阳性的死胎，其肺脏组织学检测结果均显示无明显的病理损伤。该场对不同胎龄流产情况进行了记录，其流产率仅为1．9%，并不严重；此外，分别来源于该场两头母猪的两组流产胎儿样品，其PCV3结果却均为阴性。

上述阳性样品的其他病原的qPCR检测结果均为阴性，参照Palinski等人的方法进行病毒细胞分离未获成功。将获得的2株PCV3意大利株的全基因组序列上传至GenBank，并分别命名为 PCV3-IT / CO2017（MF162298）和 PCV3-IT / MN2017（MF162299）。同源性分析表明，这两个意大利株在基因组水平上有9 9．8 5%的核苷酸序列同源性，均属于PCV3；与GenBank中已知的PCV3核苷酸相似性为 97．75% ～ 99．70%，与美国和中国重庆及江西毒株位于同一进化分支上；3个主要的ORFs与已报道的毒株相似。其中，O RF1编码复制相关蛋白（Rep蛋白），均位于223～1 133 nt处，可编码296个氨基酸，起始密码子均为“G TC”。上述意大利的2个PCV3毒株的Rep蛋白氨基酸序列相似性为99%，这主要是由于1个核苷酸的替代G856A导致保守的氨基酸发生改变E286K所致；其与所分析的PCV3毒株的Rep基因的核苷酸序列相似性为96．70%～100%，推导氨基酸序列相似性为98．65%～100%。blastp分析结果表明，Re p蛋白中存在两个保守结构域，即病毒复制蛋白超家族（9～93 aa）和典型的RNA解旋酶家族（162～ 251 aa）。ORF2与 ORF1方向相反，均位于1 343～1 987 nt处，编码Cap蛋白；意大利两个毒株Cap蛋白具有100%的推导氨基酸序列相似性，且其他毒株的相似性 为 98．13% ～ 100%。ORF3位 于602～1 907 nt处，推导编码蛋白大小为231 aa，与Rep蛋白类似，其起始密码子尚不确定。2株意大利毒株的预测起始密码子为“TTT”（编码苯丙氨酸），该起始密码子较为特殊；与Palinski等人的描述一致，位于55 aa（69 bp）的蛋氨酸可能是另一种的起始位点，可产生177个氨基酸大小的蛋白，其与PorkNW2/USA/2009（HQ738638）中的相应蛋白氨基酸序列相似性为94%。

意大利是首次报道PCV3的欧洲国家，两株意大利PCV3毒株与美国和中国毒株密切相关。如前所述，该病毒与猪繁殖障碍有关。在报道的上述两个病例中，PCV3均是唯一检测到的病原体，但PCV3的病原学作用仍不能被确定。为了更好地了解PCV3，目前正在对其流行病学，病毒学和病理学进行进一步的研究。