肺泡灌洗液GM试验对肺部侵袭性曲霉菌感染的诊断价值

单宇+刘军权+祝宇翀

[摘要] 目的 分析支气管肺泡灌洗液（BALF）半乳甘露聚糖（GM）试验结果与侵袭性肺曲霉菌培养阳性结果间的相关性。 方法 收集2014年1月～2016年12月浙江省650家医疗合作点（包括三级、二级和社区医院）8086例患有呼吸系统疾病住院患者的BALF，同时采集1459例患者血清；采用GM试剂盒，严格按照试剂盒说明书对BALF和血清样本进行GM试验，通过观察GM试验的I值结果分析对侵袭性肺曲霉菌病（IPA）的诊断价值及BALF结果分析IPA诊断符合率。用沙保弱培养基按常规方法进行真菌培养。曲霉菌鉴定：培养阳性的真菌经KOH制片，在显微镜下观察形态和颜色区分曲霉菌。 结果 8086例BALF曲霉菌培养阳性样本数为1193例。在曲霉菌阳性BALF样本中，GM试验I值<0.5为61例（5.11%）、0.5～<1.0為98例（8.21%）、1.0～<2.1为114例（9.56%）和≥2.1的为920例（77.12%），而无真菌生长组共5103例，I值<0.5为3623例（70.99%）、0.5～<1.0为827例（16.21%）、1.0～<2.1为376例（7.37%）和≥2.1为277例（5.43%），两组各I值比较差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；曲霉菌阳性组与念珠菌阳性组平均I值比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）。BALF GM试验I值与IPA诊断符合率分析：当I值设定为≥2.1，对IPA诊断的敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值分别为77.12%、94.07%、76.86%及76.85%，与I值设定≥0.5为阳性的诊断效能（分别为94.89%、9.00%、43.34%及43.34%）比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）。血清GM试验结果显示，曲霉菌阳性组I值≥0.5占30.63%，而无真菌生长组仅为6.55%，两者比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）。 结论 将GM试验BALF的I值设定为≥2.1为阳性结果，对IPA更具诊断价值，而血清GM试验I值设定为≥0.5较合适。

[关键词] 曲霉菌；肺泡灌洗液；半乳甘露聚糖；真菌鉴定

[中图分类号] R519 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）01（a）-0118-05

[Abstract] Objective To analyze the correlation between the results of galacto-mannan （GM） test in bronchoalveolar fluid （BALF） and the positive results of invasive pulmonary aspergillus. Methods From January 2014 to December 2016， 8086 BALF and 1459 serum from patients with respiratory disease in 650 cooperative medical institutions （including tertiary， secondary and community hospitals） in Zhejiang Province were collected. By using the GM test kits to carry out GM experiments in BALF and serum samples according to the instructions of the kit， the diagnostic value of the invasive pulmonary aspergillosis （IPA） was analyzed by the results of the I value， the IPA diagnosis compliance rate was analyzed with BALF results. Fungal culture was carried out in a conventional manner by using sand-fortified medium. Aspergillus identification： the fungal from the positive samples were cultured， so they could be subjected to 10% KOH based smear before microscopic observation， and then the Aspergillus were differentiated by their morphology and color. Results There were 1193 Aspergillus positive specimens among these 8086 BALF samples. In the Aspergillus positive samples， according to the results of I value of GM test： <0.5 for 61 cases （5.11%）， 0.5 to 1 for 98 （8.21%）， 1.1-2.0 for 164 （9.56%） and >2.1 for 870 （77.12%）； and in 5103 cases which had no fungal growth， the results of I value of GM test was： <0.5 for 3623 cases （70.99%）， 0.5-1 for 827 cases （16.21%）， 1.1-2.0 for 376 cases （7.37%） and >2.1 for 277 cases. There was a significant difference between these two groups （P < 0.01）. There also was a significant difference between the Aspergillus positive group and the Candida positive group （P < 0.01）. The analysis of I value of GM test in BALF and invasive pulmonary aspergillosis （IPA） diagnostic coincidence rate： When the I value was set to ≥2.1， the sensitivity， specificity， positive predictive value and negative predictive value of IPA diagnosis were as follows： 77.12% 94.57%， 76.86% and 76.85%， the differences were statistically significant （P < 0.01）； with the analysis thatwhen I value was set to be≥0.5 for positive results （94.89%， 9.00%， 43.34% and 43.34%， respectively）. The results of GM test in serum showed that the I value of the Aspergillus positive group was 0.5.63%， and the growth without fungal was only 6.54%， the differences were statistically significant （P < 0.01）. Conclusion When the I value is set to ≥2.1， the result of the GM test in BALF is significantly more valuable. When the I value isset to ≥0.5， the I value of GM test in serumis more appropriate.endprint

[Key words] Aspergillus； Bronchoalveolar lavage fluid； Galactomannan； Fungal identification

曲霉菌是侵袭性肺真菌感染（invasive fungal infections，IFI）最为常见的病原菌之一[1-2]，曲霉菌感染引起的侵袭性肺曲霉菌病（invasive pulmonary aspergillosis，IPA）也是肺侵袭性真菌病（invasive fungal disease，IFD）的主要种类。支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）测定是曲霉菌感染检测的重要实验室指标。许多实验研究发现[3-4]，应用BALF进行GM试验能为IFI的诊疗提供有价值的临床诊断依据。由于GM试验试剂盒应用说明大多局限于血清样本，在《全国临床检验操作规程》第4版中将支气管肺泡灌洗液等体液标本检测的GM试验I值≥0.5判断为阳性。由于BALF和其他血清标本来源和性质的不同，结果判断存在很大差异。为此，我们对8086例BALF的GM试验结果进行回顾性总结，提出BALF的GM试验阳性结果判断范围。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年1月～2016年12月送杭州金域医学检验所检测的8086例患有呼吸系统疾病、具有完整临床资料、临床疑诊真菌感染患者的BALF，其中男5394例，女2692例；年龄61～86岁，中位年龄72岁。在收集BALF同时，采集患者血清（实际仅采集到1459例）。BALF和血清样本来源于浙江省650家医疗合作点（包括三级、二级和社区医院）的住院患者，样本由当地医院医师或护士采集。采样完成后由杭州金域物流人员上门收取，放置于标本运输箱中，4℃冷链运输。经物流当日送达杭州金域医学检验所，统一由金域检验技术人员在样本采集后48 h内对样本进行GM试验和BALF真菌培养。

1.2 仪器和试剂

沙保培养基（广州迪景微生物科技有限公司）；曲霉菌抗原检测试剂盒（酶联免疫法，96人份/盒，美国BIO-RAD公司产品）；Sunrise酶标仪（奥地利Tecan公司）；Bio-rad洗板机（美国伯乐）；JW-3022HR高速冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）；ZW-A微量振荡仪（常州高德仪器制造有限公司产品）；生化培养箱（广东省医疗器械厂）；SSW-600-2S型电热恒温水槽（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

1.3 IPA判定

侵袭性肺部曲霉菌感染诊断标准参照欧洲癌症研究治疗组织和真菌病研究组（EOR-TC/MSG）制定的诊断标准[5]和我国制定的《肺真菌病診断和治疗专家共识》[6]及《侵袭性肺部真菌感染的诊断标准与治疗原则》[7]等有关标准，需同时符合宿主因素、临床标准和微生物学标准3个方面。本研究根据已检样本结果和患者住院期间病历、患者临床症状体征、影像及微生物学检测结果为IPA诊断依据。

1.4 样本采集方法

1.4.1 BALF采集 BALF采集按气管镜操作SOP进行，选用2%利多卡因进行麻醉，局麻后经鼻行支气管镜检测，依HRCT定位将支气管镜插入至目标亚段支气管，注入37℃灭菌生理盐水30～60 mL，进行病变部位的支气管肺泡灌洗，回收15～30 mL BALF，将回收液装入硅塑瓶中，4℃保存。

1.4.2 血清标本 行支气管镜采集BALF当日早晨使用真空采血管采集非抗凝血3 mL，4000 r/min离心10 min，4℃冰箱保存等待检测。

1.5 GM 试验

1.5.1 BALF标本的检测 将待测BALF转移入1.5 mL离心管，10 000 r/min 离心10 min，取离心后BALF上清液300 μL加入100 μL处理液混匀，100 ℃水浴3 min。10 000 r/min离心10 min，取上清备用。ELISA 检测孔每孔加入50 μL结合液、50 μL处理后上清液，37℃孵育90 min。清洗后，每孔加入375 μL清洗液，吸干；每孔加入显色液200 μL，室温避光孵育30 min后，每孔加入终止液100 μL。在波长450 nm酶标仪下读板，根据OD值换算检测BALF中GM含量。每次实验均设阴性对照、阳性对照、临界值对照，以验证实验结果的有效性。结果计算：样本指数（I值）=样本OD值/2个临界样本平均OD值。

1.5.2 血清标本的检测 试验严格按照GM试剂盒说明书操作，具体步骤如下：取待测血清300 μL加入100 μL处理液混匀，100℃水浴3 min。10 000 r/min离心10 min，取上清备用。ELISA 检测孔每孔加入50 μL结合液、50 μL处理后上清液，37℃孵育90 min。清洗后，每孔加入375 μL清洗液，吸干；每孔加入显色液200 μL，室温避光孵育30 min后每孔加入终止液100 μL；在波长450 nm酶标仪下读板，根据OD值换算检测血清中GM含量。结果换算方法同BALF样本。

1.6 真菌培养

用红外线加热器灭菌接种针/环，用接种环沾取BALF 10 μL，接种于沙保弱培养基中，放置恒温（27±1）℃培养。某些双相真菌需要同时放置37℃培养，分别于24 h、48 h和72 h观察，如果有真菌生长使用梅里埃生化鉴定板和显微镜法直接鉴定。如果无真菌生长继续培养至5～7 d，对于高度怀疑真菌感染患者标本，或怀疑某些生长较慢真菌时培养时间应延长至2～4周，每周观察，4周后无真菌生长报阴性。

1.7 曲霉菌属直接鉴定

按《全国临床检验操作规程》第4版“真菌常规制片鉴定”要求，将培养阳性的真菌用KOH制片，直接在显微镜下观察，通常曲霉菌为菌体45°角分支，直径在3～6 μm。曲霉菌属鉴定按形态学特征、菌落形态和分生孢子颜色进行群的划分，然后以分生孢子的形态、颜色、产孢结构的数目、顶囊的形态及有性孢子的形态进行菌种鉴定。endprint

1.8 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，按照厂家推荐标准，BALF和血清GM试验以待测标本的指数（I）≥0.5为诊断界值。采用四格表χ2检验分析GM试验的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值的差异，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BALF GM试验I值与真菌培养结果比较

8086例BALF曲霉菌培养阳性样本数为1193例。在曲霉菌阳性BALF样本中，I值≥2.1为920例（77.12%），而无真菌生长组≥2.1为277例（5.43%），两者结果比较差异均有统计学意义（P < 0.01）；曲霉菌阳性组与念珠菌阳性组平均I值组间结果比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）。曲霉菌阳性组I值大多≥2.1（占77.12%），而无真菌生长组为（5.43%），说明BALF的GM试验曲霉菌真阳性结果的敏感I值为2.1以上。见表1。

2.2 BALF GM试验I值与IPA诊断符合率分析

为观察GM检测对IPA诊断的灵敏度，将GM试验比色后换算的I值分别进行分组（≥0.5、≥1.1、≥2.1）比对。结果提示：當I值设定为≥2.1，对IPA诊断的敏感性、特异性、阳性预测值及阴性预测值与I值设定≥0.5者比较，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。

2.3 血清GM试验I值与真菌培养结果比较

与BALF同时送检的血清样本（同一患者同时采样）有1459例，血清经真菌培养阳性的样本有680例，其中曲霉菌阳性组为333例，其中I值<0.5为231例（69.37%）、0.5～<1.0为29例（8.71%）、1.0～<2.1为31例（9.31%）和≥2.1为42例（12.61%），与念珠菌阳性组及无真菌生长组相同I值比较，差异均有统计学意义（P < 0.01），以无真菌生长组差异最明显。I值为1.0～<2.1、≥2.1时，念珠菌阳性组与无真菌生长组比较，差异均有统计学意义（P < 0.01）。曲霉菌阳性组GM试验的I值0.5及以上者占30.63%，而无真菌生长组仅为6.55%，提示血清GM试验曲霉菌的真阳性结果的敏感值为0.5及以上。见表3。

3 讨论

IFD是宿主免疫功能低下或缺陷时真菌侵入人体，在器官、组织或血液中生长，并导致机体炎症反应和组织损伤等所致[8-10]。IFI指真菌感染气管、支气管和肺部组织，引起黏膜和肺部炎症，造成急慢性肺组织损害的疾病，临床IFI感染常见于白色念珠菌、曲霉菌属等。IPA常见于老年患者，本研究统计分析的BALF标本均来自60岁以上的老年人。老年人免疫力低下，是肺部IFI的高发人群，且临床表现缺乏特异性，常导致患者漏诊、误诊、诊断不及时从而延误疾病的治疗而增加死亡率[11-13]。侵袭性曲霉菌菌感染的治疗依赖早期的诊断和用药，但临床上诊断系统性曲霉感染经常遇到困难，病情缺乏特异的临床表现，很多患者死亡后经尸检才能发现存在曲霉菌感染。

β半乳甘露聚糖广泛分布于曲霉菌细胞壁中，是除隐球酵母和接合菌属外为曲霉菌特有的细胞成分，曲霉菌生长时半乳甘露聚糖从薄弱的菌丝顶端释放，当这些成分进入人体血液或深部组织、被吞噬细胞吞噬消化后，半乳甘露聚糖从细胞壁中释出。因此，对GM测定是曲霉菌感染的敏感指标[14-15]。GM试验常用的标本有血清和BALF。BALF是通过纤维支气管镜向支气管肺泡内注入生理盐水，随即抽吸获取肺泡表面衬液，对其中的细胞成分和可溶性成分进行分析，该项技术已成为诊断肺部疾病的重要检查手段。GM值作为检测曲霉菌细胞壁半乳甘露聚糖阴阳性的早期检测标准，在检测率、检测时间等方面的应用价值和应用效果均高于影像检查方法和生物学检查结果。目前国内尚无统一的BALF样本GM试验的cut-off值，且按全国临床检验操作规程（第四版）确定BALF样本GM样本指数≥0.5为阳性结果时在临床诊断中存在特异性不高的缺点[16]。本研究结果发现，BALF 的GM试验阳性率显著高于血清，其样本指数（I）值也明显高于血清结果，在I值≤2.1时准确性差。为此本研究回顾性总结8086例BALF的GM试验结果，并与真菌培养及临床诊断进行对比和综合分析，为GM试验样本指数I值设定一则比较切合实际的域值。

本研究8086例BALF样本中真菌培养曲霉菌阳性有1193例，其中GM阳性（设定指数I值≥2.1）有920例，占曲霉菌阳性占总检测数的77.12%，相同域值的念珠菌阳性组和无真菌生长组分别为16.26%和5.43%； BALF GM的 I值在0.5～<2.1的样本中曲霉菌培养阳性组只占总样本数的17.77%，而念珠菌阳性组和无真菌生长组为31.45%和23.58%。这些数据提示，当BALF GM试验的I值设定为≥2.1时，其对IPD诊断的特异性、真实性显著增高；设定的I值在<2.1时曲霉菌阳性组的GM试验结果阳性率反而显著低于其他组，说明该值对IPD的诊断特异性、灵敏性和真实性较低。因而，笔者建议将BALF GM试验阳性值设定为≥2.1，0.5～<2.1设定为可疑。在本研究统计的BALF样本中，有部分真菌培养阴性但GM试验I值明显升高而出现假阳性，可能原因是BALF样本与外界空气环境为开放性，使一些青霉菌、曲霉菌污染样本，或某些外抗原与GM试验有交叉反应导致 GM 实验呈现假阳性。

综上所述，如果将BALF的GM试验结果I值设定≥2.1时能提高IPA诊断的特异性（94.07%），但敏感性有所下降（77.12%），如果对某些I值较低但临床症状较典型患者增加曲霉菌靶向线粒体和核糖体靶标的PCR检测[17-18]将能弥补单一试验的缺陷，提高IPA诊断的敏感性。有报道[19]认为，增加曲霉菌PCR的检测内容，可以使IPD诊断结果灵敏度达到99%、特异性增加至98%，这些方法的联合使用可为IPD的诊断提供更有价值的实验室数据。endprint