空心莲子草总黄酮对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响

武谦虎+徐卫东+李伟东

[摘要] 目的 研究空心蓮子草总黄酮对乙肝病毒的体外抑制作用。 方法 将HepG2.2.15细胞接种于细胞培养板，然后随机分为阴性对照组、实验组和阳性对照组。阴性对照组用100 mL/L DMSO处理；各实验组分别加入800、400、200、100 mg/L的空心莲子草总黄酮，阳性对照组用800、400、200、100 mg/L的拉米夫定共培养；应用细胞培养技术和光密度测定法研究空心莲子草总黄酮对HepG2.2.15细胞系HBsAg与HBeAg表达的影响。 结果 各实验组对HepG2.2.15细胞中HBsAg的抑制率均有明显的升高，实验组与阴性对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01），实验组与阳性对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05），实验组中HBsAg的抑制率跟药物剂量呈正相关；实验组各剂量对HepG2.2.15细胞中HBeAg的抑制率均有明显的升高，实验组与阴性对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01），实验组与阳性对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05），实验组中HBeAg抑制率跟药物剂量呈正相关。 结论 空心莲子草总黄酮对HepG2.2.15细胞中HBsAg和HBeAg表达均有明显的抑制作用。体外细胞培养证实空心莲子草总黄酮有较强的抗乙肝病毒作用。

[关键词] 空心莲子草；总黄酮；HepG2.2.15细胞；HBsAg；HBeAg

[中图分类号] R969 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）01（a）-0034-04

[Abstract] Objective To study the anti-HBV action of total flavonoids extracted from Alternanthera philoxeroides in vitro. Methods HepG2.2.15 cells were inoculated into the cell culture plates and then randomly divided into negative control group， experimental group and positive control group. The negative control group was treated with 100 mL/L DMSO， the experimental groups were treated with 800， 400， 200 and 100 mg/L total flavonoids extracted from Alternanthera philoxeroides. In the positive control groups， lamivudine was added at the concentration of 800， 400， 200 and 100 mg/L. Cell culture and optical density assay were used to study the effects of total flavonoids from Alternanthera philoxeroides on the expression of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cell line. Results The inhibit the expression of HBsAg in HepG2.2.15 cells in each experimental group was obviously higher， compared with the negative group， the difference was statistically significant （P < 0.01） and compared with the positive control group， the difference was statistically significant （P < 0.05）， the inhibition rate of HBsAg in the experimental group was positively correlated with the dose of the drug. Each dose of the experimental groups had obvious inhibitory effects on the expressions of HBeAg in HepG2.2.15 cells， compared with the negative control group， the difference was statistically significant （P < 0.01） compared with and positive control group， the difference was statistically significant （P < 0.05）， the inhibition rate of HBeAg in the experimental group was positively correlated with the dose of the drug. Conclusion Total flavonoids extracted from Alternanthera philoxeroides has obvious inhibitory effects on the expressions of HBsAg and HBeAg in HepG2. 2. 15 cells. Total flavonoids extracted from Alternanthera philoxeroides has strong anti-HBV action in vitro.endprint

[Key words] Alternanthera philoxeroides； Total flavon?oids； HepG2. 2. 15 Cells； HBsAg； HBeAg

空心莲子草为苋科植物空心莲子草Alternanthera philoxeroides（Mart.）Griseb.的干燥全草，又名空心苋，水花生。原产巴西，后随植物种子带入我国成为农业有害杂草。我国自20世纪70年代起，开始空心莲子草防治感染性疾病的临床应用研究。据《中药大辞典》记载，本品性寒、味苦；具有清热、凉血、解毒的功效。现代临床用于治疗麻疹、乙型脑炎、流行性出血热、急性肝炎等病毒性疾病。本课题组前期研究发现空心莲子草对四氯化碳、半乳糖胺、乙醇所致的化学性肝损伤和卡介苗+脂多糖所致的免疫性肝损伤均具有一定的保护作用[1-3]；临床观察也表明空心莲子草能有效改善慢性乙肝患者的肝脏功能和临床症状[4]；尚有文献报道其提取物体外具有抗多种病毒[5]和增强机体免疫功能[6]等作用。为探讨空心莲子草对乙肝病毒体外抑制作用，为空心莲子草用于治疗乙型肝炎提供理论依据，本研究提取分离了空心莲子草的总黄酮部位，且用该提取物做了HepG2.2.15细胞培养试验，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 药物、主要试剂和仪器

HBeAg、HBsAg试剂盒（上海科华公司，批号：2016120066），胎牛血清（上海双洳生物科技有限公司，批号：20161212），DMEM、G418、谷氨酰胺均为分析纯试剂。二氧化碳培养箱（美国HealForce公司），倒置相差显微镜（日本Nikon公司，型号：TS100 Nikon），超净台（中国苏州枫桥净化设备有限公司），细胞培养盒、96孔细胞培养板（美国Coming），酶标仪（美国molecular device公司，型号：Spectra Max 190）。HepG2.2.15细胞：南京大学徐力致老师惠赠。药物空心莲子草于2013年11月采集于江苏省镇江市丹徒区西麓镇，经中国药科大学黄达芳副教授鉴定为空心莲子草 A. philoxeroides（Mart.）Griseb.。从空心莲子草中提取分离出总黄酮（经南京中医药大学药学院江苏省中药炮制重点实验室波谱解析确定其主要成分为黄酮类化合物）。拉米夫定（中国苏州葛兰素史克制药有限公司，批号：16120014）

1.2 方法

1.2.1 药物制备 ①供试药制备。空心莲子草粗粉300 g，采用回流提取法，分别以药材量12、10、10倍量60%乙醇溶液提取3次，每次提取1 h，过滤合并滤液，减压回收溶剂至无醇味。使用D101树脂精制，上样液浓度为6 mg/mL，上样量100 mg/g干树脂，以50 g/L NaHCO3调节pH值至6，上样液流速2 mL/min，吸附1 h。先用提取物量5倍体积水洗脱，再用10倍体积70%乙醇溶液洗脱，洗脱流速3 mL/min。收集70%乙醇溶液洗脱液，减压回收至无醇味，经波谱解析确定结构，即得空心莲子草总黄酮。②药物配制。空心莲子草总黄酮和拉米夫定分别用1000 mL/L二甲基亚砜（DMSO）溶解，配制成160 mg/L浓度，再以50 g/L NaHCO3调节pH值至6.8～7.2，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌备用。

1.2.2 HepG2.2.15细胞系的培养体系 在DMEM中加入150 mg/L胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，380 mg/L G418，10 mL/L链霉素、青霉素，以50 g/L NaHCO3调节pH值至7.2～7.4培养，每10天传代一次。

1.2.3 空心莲子草总黄酮细胞毒性试验 将HepG2.2.15细胞按1×108/L接种于细胞培养板，然后随机分成阴性对照组、实验组和阳性对照组，分别在阴性对照组中加入100 mL/L DMSO；实验组各组中加入800、400、200、100 mg/L浓度的空心莲子草总黄酮，阳性对照组各组中加入800、400、200、100 mg/L浓度的拉米夫定共培养。参照文献[7，8]，在其规定条件下培养、吸去上清液、固定细胞、洗涤、抽取测试所需细胞上清液，用自动酶标仪于在吸收波长 515 nm条件下，测定该细胞上清液吸光度（A）。

1.2.4 空心莲子草总黄酮对HepG2.2.15细胞系HBsAg与HBeAg表达的影响 参照文献[7-8]，按其方法接种和培养HepG2.2.15细胞，然后以800、400、200、100 mg/L的药物浓度将实验组和阳性对照组各组份加入细胞板中，每个浓度设2个孔，设100 mL/L DMSO组8孔为阴性对照组，分别于第3、6、9天取培养基上清液于-200℃冻存，测定A值，计算药物对HBsAg、HBeAg分泌的抑制率（%）[抑制率（%）=（对照组吸光度值-给药组吸光度值）/（对照组吸光度值-空白组吸光度值）×100%]、50%抑制浓度（IC50）、治疗指数（TI=CD50/IC50）。当TI>2时为有效，TI=1时为毒性作用较强，TI<1时为毒性作用强。

1.3 统计学方法

应用SPSS 11.5统计学软件进行统计处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 空心莲子草总黄酮对 HepG2.2.15细胞系 HBsAg表达的抑制作用

应用 HepG2.2.15细胞系培养系统实验证明：实验组中各剂量组对HBsAg的抑制率均有明顯的升高（表1）。实验组与阴性对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）；实验组与阳性对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；实验组中HBsAg的抑制率跟药物剂量呈正相关。表明空心莲子草总黄酮对对HepG2.2.15细胞中HBsAg表达有明显的抑制作用。endprint

2.2 空心莲子草总黄酮对 HepG2.2.15细胞系 HBeAg表达的抑制作用

应用HepG2.2.15细胞系培养系统实验证明：实验组各剂量组对HBeAg的抑制率均有明显的升高。实验组与阴性对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）；实验组与阳性对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；实验组中HBeAg抑制率跟药物剂量呈正相关（表2）。表明空心莲子草总黄酮对对HepG2.2.15细胞中HBeAg表达有明显的抑制作用。

3 讨论

本实验从空心莲子草中提取分离出空心莲子草总黄酮，研究发现其对HBsAg和HBeAg表达均有明显的抑制作用（HBsAg和HBeAg的抑制率，实验组与阴性对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）；实验组与阳性对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；实验组中HBsAg和HBeAg的抑制率跟药物剂量均呈正相关），从细胞药理学研究水平上证实空心莲子草总黄酮具有较强的体外抗HBV活性。本实验也发现，空心莲子草总皂苷对HBsAg和HBeAg表达均有明显的抑制作用（与阴性对照组比较，P < 0.01；与阳性对照组比较，P < 0.05），同时采用定量PCR方法检测，空心莲子草总皂苷（200 mg/L）可使培养基中HBV-DNA转阴。

曾有学者从从空心莲子草中分离鉴定了10个三萜皂苷类化合物，抗HBV活性筛选表明，齐墩果酸（oleanolic acid）和4，5-dihydroblumenol 具有较强的抗HBV活性[4，9]。近年来，对空心莲子草抗病毒的药效物质基础进行了研究，确定了其有效物质部位主要为黄酮和皂苷类化合物[10-12]。以上表明空心莲子草对乙肝病毒具有较好的体外抑制作用。

既往研究表明，空心莲子草对呼吸道合胞病毒、甲型H3N2流感病毒等病毒均有抑制作用[13-15]。提示空心莲子草是具有较好开发应用前景的抗病毒中草药。空心莲子草曾以注射剂收录于中国药典（一部，1977年版），用于治疗麻疹、流行性出血热、病毒性肝炎等病毒性感染。但其抗乙肝病毒作用的药效学作用及物质基础并不十分明确，尤其其抗乙肝病毒作用分子细胞药理学的研究比较欠缺。

乙型肝炎由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的慢性传染性疾病。全球共有20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性HBV 感染者，每年约有78.6万人死于慢性HBV感染相关肝病。尽管乙型肝炎疫苗接种已使我国新发感染者得到明显控制，但我国仍有慢性HBV感染者约8000万例，其中慢性乙型肝炎患者高达2000余万例[16]。临床统计资料显示，在慢性HBV感染者中，15%～25%最终死于与HBV感染相关的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌（hepatocellular carci?noma，HCC），其中慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）、代偿期和失代偿期肝硬化患者的5年病死率分别为0～2%、14%～20%和70%～86%[17]，严重危害人类健康，必须尽快接受规范的抗乙肝病毒治疗。仅十多年来，尽管随着核苷类乙肝抗病毒药物拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定、恩替卡韦、替诺福韦等不断上市，对乙肝病毒有较好的抑制作用，但停药后乙肝病毒变异或复发以及彻底从体内清除乙肝病毒如HBV-cccDNA模板非常困难等诸多问题，仍然一直困扰着医药学研究工作者。因此寻找安全有效的抗HBV药物是医药学工作者必须攻克一项医学难题。

HepG2.2.15细胞是人肝癌细胞系HepG2细胞衍生，经HBV-DNA克隆和转染的人肝癌细胞HepG2.2.15细胞系，能转录、翻译HBV基因，且其能较为稳定、持久地向培养上清液中分泌HBsAg、HBeAg和HBV颗粒，细胞上清液中也可以测得到HBV-DNA。故HepG2.2.15细胞系便于应用荧光定量检测仪检测HBsAg、HBeAg和HBV DNA，并对人有感染性，故是目前体外公认的抗HBV药物体外高通量筛选和评价较好的细胞模型之一[18-21]。

为了阐明空心莲子草治疗慢性乙肝的理论依据，今后尚需进一步从化合物单体水平证明空心莲子草所含其他有效成分的抗HBV活性，并需对其进行体内抗HBV活性及机制的深入探讨，然后在充分临床前研究基础上进行多中心随机对照的药物临床试验，争取开发出用于临床乙肝抗病毒治疗的天然药物。

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（收稿日期：2017-09-11 本文编辑：李雅南）endprint