骨桥蛋白与肾结石形成机制的研究进展

夏煜琦+程帆+袁润

[摘要] 骨桥蛋白（OPN）为泌尿系结石基质主要有机成分之一，在肾结石患者及动物模型肾组织内含量明显增高。在肾结石形成各阶段包括晶体黏附、氧化应激、细胞凋亡等过程中扮演关键角色。OPN大量表达将导致晶体沉积，结石形成，最终造成肾脏细胞损伤。抗OPN抗体、抗氧化物及凋亡通路抑制剂能显著减轻OPN介导的结石形成。本综述旨在讨论近年来骨桥蛋白在肾结石形成机制中的新进展以及针对OPN的新的结石预防治疗靶点。

[关键词] 骨桥蛋白；晶体黏附；氧化应激；细胞凋亡；肾结石

[中图分类号] R692.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）01（a）-0045-04

[Abstract] OPN is one of the main components of the organic phase of stone， which is highly expressed in the renal tissue of the kidney stones patients and animal stone models， and plays an important role in the process of crystal aggregation and adhesion， oxidative stress of renal tubular epithelial cells and apoptosis. A large amount of OPN expression will lead to crystal deposition， stone formation， resulting in kidney cell damage. OPN antibodies， antioxidants and apoptotic pathway inhibitors can significantly reduce OPN mediated stone formation. This review aims to discuss recent advances of the role of osteopontin in the formation of kidney stones and the new stone prevention and treatment target for OPN.

[Key words] Osteopontin； Crystal adhesion； Oxidative stress； Apoptosis； Kidney stone

肾结石是泌尿系统的常见病、多发病，流行病学研究显示，肾结石的患病率及发病率逐年递增[1]，在我国，患病率为0.12%～6.02%[2]。同时，由于结石病易复发，并发症多，已成为很多患者严重的负担。目前肾结石的形成机制仍旧不清楚，传统观点认为肾结石的形成过程包括尿液过饱和、晶体核心形成、晶体成长及聚集，然而目前越来越多的研究者强调肾小管上皮细胞与结石晶体间的相互影响[3]。骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是草酸钙结石基质的重要成分[4]，可能通过促进晶体黏附及介导氧化应激、细胞凋亡促进结石的形成[5]。对OPN与肾结石形成机制的研究，有助于为肾结石寻找新的预防及治疗靶点。

1 OPN研究现状

1.1 OPN概述

骨桥蛋白又被称为分泌性磷蛋白-1（secreted phosphoprotein-1，SSP1），是小整合素结合配体N连接的糖蛋白家族的一员[6]，为分子量34 kDa带负电荷的磷酸化糖蛋白[4]。OPN的生物学活性取决于三个特异性结构，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD，氨基酸159-161）序列，凝血酶裂解位点（Arg168-Ser169）及钙离子结合位点（氨基酸86-95）[7-8]。RGD序列通过整合素，参与晶体黏附于上皮细胞、细胞内信号转导等过程[7]。OPN被凝血酶裂解后，隐藏的整合素连接位点162SVVYGLR168暴露，促进与整合素的连接[8]。钙离子结合位点具有10个天冬氨酸（Asp）残基，参与钙化過程。

1.2 OPN主要功能

OPN广泛分布于胆囊、尿路、消化道、肺和乳房等组织以及乳汁、胆汁、尿液等体液内。树突样细胞，巨噬细胞，大脑及肾脏组织都可以分泌OPN。肾脏内OPN于远端小管以及集合管内生成[9]。OPN在调节细胞基质重构、组织钙化、单核-巨噬细胞迁徙趋化、促炎细胞因子的释放及细胞凋亡方面发挥重要作用，同时也与一系列病理生理过程相关，例如恶性肿瘤、胰岛素抵抗、骨质疏松、泌尿系结石等[10]。

2 OPN与肾结石

2.1 OPN与成石物质

结石为无机相及有机相混合形成，其中有机相占干重约5%[11]。由于结石不可能在快速流动的尿液中形成，很多研究者认为，结石是在黏附于肾脏组织的过程中形成并生长的，这些生长相关的有机成分来源于肾脏组织。对结石成分分析发现，OPN作为有机相存在于草酸钙及磷酸钙结石内，并且是结石有机成分中含量最为丰富的蛋白之一[4]。肾结石晶体沉积发生于肾乳头钙斑（randall plaques，RPs），Taguchi等[12]利用免疫组织化学透射电镜，在结石患者肾脏内发现，RPs内OPN水平及分布也显著高于正常肾组织。然而，对正常人及肾结石患者尿液进行光谱质谱分析发现，OPN在正常人及结石患者尿液中含量并没有明显差异[13]。

2.2 OPN表达与肾结石

OPN作为肾结石基质的重要成分，在晶体形成中担任关键角色。在乙二醇诱导的草酸钙结石动物模型肾脏组织中，OPN在mRNA及蛋白水平显著升高，同时造成肾脏损伤，肌酐清除率下降[14]。Tsuji等[15]，使用siRNA沉默SD大鼠OPN基因发现，OPN下调时，肾脏内草酸钙晶体沉积明显减少。大量细胞试验及动物试验证明，在结石产生过程中，OPN高表达，并促进结石形成[9，16]。endprint

然而，也有研究者认为，OPN为肾脏钙质沉着及结石形成的有效抑制剂。Mo等[17]，将OPN基因敲除小鼠与野生型对比发现，敲除小鼠肾乳头间质磷酸钙沉积更多。将小鼠尿液，一水草酸钙晶体及狗肾小管细胞系（MDCK）混合培养发现，在OPN敲除基因小鼠的尿液中培养的细胞系，晶体与上皮细胞黏附明显增加。

关于OPN作用的争论，可能是由OPN的结合/游离状态不同而导致，游离OPN能抑制晶体核心形成、晶体成长和聚集[18]，然而，由于骨桥蛋白的强阴离子活性，它与钙离子之间有强大的结合力，导致游离的骨桥蛋白在体内很少见[19]。而结合骨桥蛋白为晶体聚集以及黏附的促进剂。因此，可能是某些因素影响了OPN与钙离子/草酸根离子结合，进而改变游离OPN与结合OPN间的比例，影响结石晶体形成，从而产生了对OPN作用的矛盾结论。

2.3 OPN与晶体黏附

OPN作为细胞外基质的主要成分，参与钙盐晶体形成，并介导晶体黏附于肾小管上皮细胞。Kumar等[20]对24位结石病患者与正常人尿液离心、超滤及再处理，发现OPN包绕的晶体黏附能力显著增强。Hirose等[21]观察肾小管上皮细胞在结石形成早期的微观结构，发现肾小管细胞损伤后，以OPN为核心物的晶体在肾脏皮质髓质连接处黏附于上皮细胞。此外，在OPN基因敲除鼠肾组织中，结石晶体碎片化，晶体数减少及晶体大小减小[22]。OPN介导的黏附作用与其结构上整合素结合位点162SVVYGLR168相关[8]。这些研究表明，OPN在结石形成过程中，一方面作为结石基质的一部分，与结石的形成有关；另一方面，包绕成石晶体，促进晶体与肾小管细胞间的黏附作用，并且与肾小管细胞受损后的晶体黏附密切相关。

2.4 OPN与氧化应激

实验及临床研究证实结石患者肾脏内，氧化应激（oxidative stress，OS）的发生[23]。抗氧化能力减弱将导致晶体增加，结石形成[24]。在结石发生早期阶段，肾小管上皮细胞损伤，线粒体内部结构破坏，空泡形成，胞膜微绒毛减少，缩短[21]。细胞损伤促发氧化应激，谷胱甘肽浓度下降，花生四烯酸增加[25]，同时OPN表达升高，促进前列腺素E2（PGE2）、单核细胞趋化蛋白（MCP-1）等与炎症相关因子的合成增加[26]。氧化应激与炎症因子的产生将造成肾小管上皮细胞进一步损伤与结石形成。用抗氧化剂，如NADPH氧化酶抑制剂干扰后，肾小管细胞中反应活性氧，OPN的水平下调，并且减轻了结石晶体诱发的氧化损伤[24，26]。

2.5 OPN与细胞凋亡

Niimi等[27]，在乙二醇诱导的SD大鼠草酸钙结石模型中观测到：线粒体亲环素D激活，线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）损伤开放，线粒体塌陷，氧化应激及凋亡通路启动，OPN大量表达，促进晶体黏附于肾小管细胞。mPTP阻滞剂环孢素A（cyclosporine A，CsA），亲环素D抑制剂N-甲基-4-异亮氨酸环孢素（N-methyl-4-isoleucine cyclosporin，NIM811）能阻止mPTP开放，减轻凋亡水平，显著抑制OPN表达，减少晶体沉积[27-28]。Bhardwaj等[29]，发现OPN表达水平与内质网应激水平的相关性。可能通过CD44受体[30]，激活内质网应激，增加-内质网向线粒体转运的钙离子流，促进线粒体坍塌，激活凋亡通路[29]。这些研究表明，在结石形成早期阶段，一方面，OPN能诱发内质网应激，mPTP，线粒体坍塌激活凋亡通路；另一方面，在凋亡通路启动后，大量表达，增强晶体黏附能力。

3 靶向OPN的治疗策略

包括维生素E、绿茶、活血丹、褪黑素及柠檬酸钾等在内的抗氧化物，能通过抑制OS，减少OPN表达以及肾脏组织内结石晶体的形成[22，24]。肾结石动物模型中，肾脏组织内氧化应激标志物，肾损伤分子-1（KIM-1）及OPN水平显著升高，草酸钙晶体沉积。而食用抗氧化剂活血丹，柠檬酸钾后各指标显著下调[22]。这些抗氧化剂，可用于结石高危人群，例如尿路梗阻感染、高草酸尿癥、代谢综合征患者预防结石形成，或体外冲击波碎石术后预防结石复发。

通过抑制凋亡通路的关键因子，能减轻凋亡，减少OPN表达及结石形成。mPTP阻滞剂CsA，亲环素D抑制剂NIM811能抑制mPTP开放，抑制细胞损伤及凋亡通路激活，OPN表达及早期草酸钙晶体形成[27-28]。对凋亡通路各个重要环节的抑制，可能成为未来对抗结石的新靶点。

抗OPN抗体能影响凝血酶对OPN的裂解，通过抑制黏附抑制结石的早期形成。Hamamoto等[8]在乙醛酸诱导的小鼠模型中，腹腔注射鼠抗OPN抗体（anti-murine osteopontin antibody，35B6-Ab）显著减轻肾脏晶体黏附，晶体形成及细胞损伤。

游离OPN能抑制晶体核心形成、晶体成长和聚集，而结合OPN则正好相反[18-19]，游离OPN与结合OPN的转换过程目前仍然不清楚，若能抑制OPN与钙离子的结合，减少结合OPN，增加游离OPN，或许能够发挥游离OPN的功能，抑制结石的形成。

4 讨论

综上所述，OPN从三方面促进肾结石形成：①尿路中草酸盐的浓度过高，结石早期形成。OPN作为结石核心的一部分，促进晶体间聚集及黏附，并促进晶体黏附于肾小管管腔。②晶体黏附于肾小管上皮细胞后，被内吞进入胞内溶酶体或者释放到肾脏间质被降解[11]。黏附于肾小管细胞上的结石晶体，能促进OPN大量表达及NADPH氧化酶反应生成大量过氧化物。③OPN促进内质网应激，激活亲环素D，线粒体通透性转换孔（mPTP）损伤开启，线粒体死亡，凋亡通路启动，OPN大量表达，促进晶体黏附于肾小管细胞。同时，巨噬细胞对小晶体吞噬并且消化，生长过快的晶体巨噬细胞无法消化，晶体进一步聚集并且排入管腔。endprint

OPN作为结石组成成分，在结石形成肾组织内高表达，在晶体聚集与黏附，肾小管上皮细胞损伤氧化应激、凋亡等过程发挥重要作用。抗OPN抗体、抗氧化剂、凋亡抑制剂等能通过抑制OPN产生，减少肾组织内晶体形成及沉积，减轻肾脏损伤，能为临床预防及治疗肾结石提供新的有效方法。

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（收稿日期：2017-09-19 本文編辑：任 念）endprint