人参皂苷Rg1对大鼠视神经损伤的保护作用研究

胡楚璇+李穗华+张霞

[摘要] 目的 觀察人参皂苷Rg1对大鼠视神经损伤的保护作用，并探讨其保护机制。 方法 将Wistar大鼠随机分为对照组、模型组和治疗组，每组30只。对照组大鼠不建模腹腔注射生理盐水，模型组大鼠腹腔注射生理盐水，治疗组大鼠建模后腹腔注射人参皂苷Rg1（50 mg/kg），连续给药7 d。采用视神经夹挫伤法建立视神经损伤大鼠模型，建模5 d后所有大鼠右侧上丘注射荧光金标记视网膜神经节细胞（RGCs），处死前行闪光视觉诱发电位检测，处死后比较眼球RGCs密度、RGCs凋亡情况、诱发电位P1波、视神经胆固醇含量、沉默信息调节因子1（SIRT1）蛋白和羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）表达情况。 结果 在大鼠处死后7、14、21 d，随着处死时间的延长，对照组视觉诱发电位、视网膜凋亡细胞数没有显著性变化，模型组、治疗组视觉诱发电位、视网膜凋亡细胞数逐渐升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；相同时间点模型组视觉诱发电位、视网膜凋亡细胞数显著高于对照组，治疗组视觉诱发电位、视网膜凋亡细胞数显著低于模型组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。随着处死时间的延长，模型组、治疗组RGCs密度、视神经胆固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平逐渐升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；相同时间点模型组RGCs密度、视神经胆固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平显著高于对照组，治疗组RGCs密度、视神经胆固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平显著低于模型组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 人参皂苷Rg1对大鼠视神经损伤性疾病有明显的保护作用，其机制可能与上调SIRT1和HMGCR基因的表达，进而影响视神经胆固醇合成有关。

[关键词] 视神经损伤；大鼠；人参皂苷Rg1；视网膜神经节细胞

[中图分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）01（c）-0017-05

[Abstract] Objective To observe the protective effect of ginsenoside Rg1 on optic nerve injury in rats and its protective mechanism. Methods Wistar rats were randomly divided into control group， model group and treatment group， with 30 rats in each group. Rats in the control group were injected intraperitoneally with saline without modeling. Rats in the model group were intraperitoneally injected with saline. Rats in the treatment group were intraperitoneally injected with ginsenoside Rg1 （50 mg/kg） for 7 d. The model of optic nerve injury was established by occlusion of the optic nerve. After 5 days of modeling， fluorescein-labeled retinal ganglion cells （RGCs） were injected into the right superior colliculus on the right side of the rats. Flash visual evoked potentials were detected before the rats were sacrificed. RGCs density， apoptosis of RGCs， P1 wave of evoked potential， optic nerve cholesterol content， silent information regulator 1 （SIRT1） protein and HMG-CoA reductase （HMGCR） expression were detected after the rats were sacrificed. Results At 7， 14， 21 days after sacrifice， the visual evoked potentials and the number of retinal apoptotic cells in the control group did not change significantly with the prolongation of sacrifice time. The visual evoked potentials and the number of retinal apoptotic cells in the model group and treatment group were increased gradually （P < 0.05）. At the same time point， the number of visual evoked potentials and retinal apoptotic cells in the model group were significantly higher than those in the control group， the visual evoked potential， the number of retinal apoptotic cells in the treatment group were lower than those in the model group （P < 0.05）. The RGCs density， optic nerve cholesterol， SIRT1 and HMGCR protein levels in the model group and treatment group were increased gradually with the prolongation of sacrifice time （P < 0.05）； at the same time， RGCs density， optic nerve cholesterol， SIRT1 and HMGCR protein levels in the model group were significantly higher than those in the control group， the RGCs density， optic nerve cholesterol， SIRT1 and HMGCR protein levels in the treatment group were lower than those in the model group （P < 0.05）. Conclusion Ginsenoside Rg1 has a significant protective effect on optic nerve injury in rats， the mechanism may be related to the up-regulation of the expression of SIRT1 and HMGCR genes and the synthesis of optic nerve cholesterol.endprint

[Key words] Optic nerve injury； Rat； Ginsenoside Rg1； Retinal ganglion cells

视神经损伤是眼科最常见的外伤性疾病之一，随着交通事故的不断增加，其发病率呈逐年递增的趋势[1]。由于视神经细胞和RGCs再生修复能力弱，且具有连锁反应，小部分细胞受到暴力因素坏死后将引起大部分细胞凋亡[2]。如何阻止RGCs凋亡的进程，从而最大程度保护视力是目前研究的热点[3-4]。人参是著名的传统中药，药理作用广泛，随着中药药理学的发展，人参的活性成分不断被提炼、萃取[5-6]。最新研究发现，人参皂苷Rg1在抑制神经细胞凋亡方面具有一定的疗效，但人参皂苷Rg1对RGCs的作用尚未完全清楚。本研究旨在探究Rg1对大鼠RGCs的保护作用。

1 材料与方法

1.1 试验动物

SPF级雄性Wistar大鼠90只，购自南方医科大学动物实验室（合格证号：SCXK2012-0007），9～10周龄，体重（250±20）g。动物室保持空气流动通畅，相对湿度55%～65%，温度（23±2）℃。所有大鼠按常规方法饲养，全程监测并对一般情况进行记录。

1.2 试剂

人参皂苷Rg1粉剂（购自中国成都曼思特生物科技有限公司，批号：A0237），溶于生理盐水配成12 g/L溶液；Fluorochrome荧光金（深圳市豪地华拓生物科技有限公司，批号：52-9500）；SIRT1、HMGCR及GAPDH兔抗大鼠多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3 仪器

德国Medicon动脉夹（北京科惠康医疗器械有限公司）；Leica M525手术显微镜（德国徕卡公司）；Olympus CX23荧光显微镜（上海维翰光电科技有限公司）；MoreChina分光光度计和IVE-205A视觉电生理检查仪（重庆上邦医疗设备有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 建模及分组 模型建立参考文献[7]，并作适当修改。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg），麻醉成功后消毒右眼，于显微镜下将球结膜剪开作钝性分离，暴露右侧视神经眶内段，用动脉夹在距视神经根部2 mm处夹持15 s，逐层缝合后于结膜囊内涂红霉素眼膏。术后大鼠右眼瞳孔散大，无视网膜出血、眼睑闭合不全及眼球突出认为建模成功。将大鼠随机分为三组，每组30只。对照组大鼠不建模腹腔注射生理盐水，模型组大鼠腹腔注射生理盐水，治疗组大鼠建模后腹腔注射人参皂苷Rg1（50 mg/kg），连续给药7 d。所有大鼠于建模后5 d在右侧上丘注射荧光金标记RGCs。

1.4.2 闪光视觉诱发电位检查 大鼠腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg），麻醉成功后备皮消毒，将视觉电生理检查仪的电极针刺入皮下，设定右侧耳廓为地电极，右侧颊部为参考电极，记录电极为两耳尖连线中点在颈项部的投射点，阻抗标准≤4Ω。左眼用黑眼罩遮挡，适应10 min后对右眼进行强度为3.85 cd/m2的光刺激，频率为2.1 Hz，获取诱发电位P1波的潜伏期及波幅，重复测量3次取平均值。

1.4.3 RGCs观察 颈椎脱臼法处死大鼠，摘取右侧眼球，多聚甲醛-PB固定液（0.15 mol/L，pH 7.4）浸泡20 min，于显微镜下依次剥除角膜、晶状体和玻璃体，取出视网膜并标记面积相等的4个象限，分别代表鼻上、鼻下、颞上和颞下，固定液浸泡30 min。用PBS缓冲液（0.15 mol/L，pH 7.4）漂洗3次后平铺于载玻片，盖玻片封片。每个象限于低倍镜下随机选取3个样本区，调整为紫外光激发模式，于高倍镜下计数每个样本区的存活RGCs，取平均值得到存活RGCs密度。

1.4.4 视神经胆固醇、SIRT1和HMGCR基因的蛋白检测 将计数后的视网膜剪碎，制备成2 mL匀浆，以3000 r/min离心20 min，取上清液等分为2份，其中1份经氧化酶-过氧化物酶法测定胆固醇含量，具体为：将上清液加入到1 mL工作液（缓冲液和过氧化酶1∶1混合）中37℃水浴15 min，然后在500 nm波长分光光度计下测定吸光度值A，每10克细胞蛋白中胆固醇含量=（测定A/标准A×标准液浓度×150）/样品重量×10；另1份先通过Bradford法测定总蛋白浓度，再取SIRT1、HMGCR及GAPDH兔抗大鼠多克隆抗体经浓缩胶、分离胶恒压处理后，分别用TBST缓冲液洗膜4次，5 min/次。最后用TBS缓冲液洗膜15 min后显色。将结果扫描到计算机中，用Quantity one软件分析，GAPDH为标准浓度，SIRT1和HMGCR为待测浓度，用灰度积分的比值计算SIRT1和HMGCR蛋白的含量。

1.4.5 TUNEL法检测RGCs凋亡情况 分别于给药后不同时间点处死Wistar大鼠，摘除右眼眼球，4%甲醛固定24 h后制成石蜡切片，按TUNEL凋亡检测试剂盒（瑞士，Roch公司）说明书进行视网膜RGCs的凋亡检测。所有切片在同一光照强度下，随机在每个切片中取3个视野进行观察，计数TUNEL阳性细胞，取其平均数（每高倍视野均数）。

1.5 统计学方法

实验数据采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，计量资料均以均数±标准差（x±s）表示，采用重复测量方差分析。经方差齐性检验，若方差齐性则组间两两比较采用最小差值法（LSD）法，若方差不齐将采用Dunnett T3法进行两两比较。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠视觉诱发电位检查结果比较

随着处死时间的延长，对照组视觉诱发电位没有显著性变化（P > 0.05），模型组、治疗组视觉诱发电位逐渐升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；相同时间点模型组视觉诱发电位显著高于对照组，治疗组视觉诱發电位低于模型组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表1。endprint

2.2 各组大鼠存活RCGs密度比较

随着处死时间的延长，对照组RGCs密度没有显著性变化（P > 0.05），模型组、治疗组RGCs密度逐渐下降，差异有统计学意义（P < 0.05）；相同时间点模型组RGCs密度显著显著低于对照组，治疗组RGCs密度高于模型组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠视神经胆固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平比较

随着处死时间的延长，对照组视神经胆固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平没有显著性变化（P > 0.05），模型组、治疗组视神经胆固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平逐渐下降，差异有统计学意义（P < 0.05）；相同时间点模型组视神经胆固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平显著低于对照组，治疗组视神经胆固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平高于模型组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表3～4。

2.4 视网膜凋亡细胞数的变化

随着处死时间的延长，对照组视网膜凋亡细胞数没有显著性变化（P > 0.05），模型组、治疗组视网膜凋亡细胞数逐渐升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；相同时间点模型组视网膜凋亡细胞数显著高于对照组，治疗组视网膜凋亡细胞数低于模型组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表5。

3 讨论

车祸、坠落和打击伤是视神经损伤最常见的原因，主要表现为视力下降及视野缺损。研究发现，视神经在受到挤压后早期仅有少量RGCs坏死，随着时间延长，周围未受到挤压的RGCs不断发生凋亡[8]。以大鼠为例，在视神经受到挤压后10% RGCs坏死的情况下，伤后7 d RGCs死亡比例可达40%，伤后14 d高达70%，最终仅剩10%左右的RGCs存活。除视神经损伤外，RGCs数量下降同样是青光眼、视神经炎等多种眼科疾病的病理特征[9-10]。以往在治疗严重视神经损伤方面无特效方法，多数患者视力不断下降，仅能维持在光感水平，严重影响生活質量[11]。

人参活性成分最具代表性的是皂苷类，其中Rg1具有抗衰老[12]、抗氧化[13]、提高免疫力[14]及增强记忆力的功效[15]，在抗心肌细胞及神经元损伤中效果显著，对中枢神经系统有明显的兴奋作用，其机制可能与多种途径有关[16]。研究发现Rg1可通过降低小鼠脑组织中H2O2和羧基化蛋白含量，提高SOD含量，从而降低神经元中脂褐素的积累，减轻线粒体结构的损伤[17]。彭彬[18]研究认为Rg1可通过促进脑内DNA、RNA及蛋白质的合成，从而抑制神经细胞凋亡。视神经挤压伤后给予腹腔注射Rg1治疗，在一定程度上能延缓RGCs死亡，提高RGCs存活率，具有一定的神经保护作用[19]。研究表明，人参皂苷Rg1对视网膜氧化应激损伤有保护作用，其作用机制可能与抑制大鼠视网膜BACE1表达上调有关[20]。体外研究表明，人参皂苷Rg1具有良好的保护视网膜神经节细胞免受损伤的作用[21]。人参皂苷Rg1具有对抗NMDA诱导的RGCs凋亡、保护视网膜神经节细胞、增强其活性的作用[22]。因此笔者推测人参皂苷Rg1对视神经损伤后的RGCs同样具有保护作用。本研究选用了国内外公认的大鼠视神经夹挫伤模型，其具有直视下操作、损伤程度可定量等优势。

本研究结果显示，随着处死时间的延长，对照组视觉诱发电位、视网膜凋亡细胞数没有显著性变化，模型组、治疗组视觉诱发电位、视网膜凋亡细胞数逐渐升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；相同时间点模型组视觉诱发电位、视网膜凋亡细胞数显著高于对照组，治疗组视觉诱发电位、视网膜凋亡细胞数低于模型组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。随着处死时间的延长，模型组、治疗组RGCs密度、视神经胆固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平逐渐升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；相同时间点模型组RGCs密度、视神经胆固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平显著高于对照组，治疗组RGCs密度、视神经胆固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平低于模型组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。与Wang等[10]的结论一致，说明Rg1在阻止RGCs凋亡进程上效果显著。细胞损伤后的凋亡过程受基因调控，张燕等[23]研究发现，视神经损伤后小鼠视网膜中胆固醇水平随损伤时间延长不断下降，而在胆固醇的合成代谢过程中，SIRT1-HMGCR调控通路起重要作用。本研究发现，不同组别SIRT1和HMGCR蛋白表达差异显著，因此笔者推测人参皂苷Rg1对RGCs的保护作用可能与上调SIRT1和HMGCR基因表达，进而促进胆固醇合成有关。本研究仍存在以下三点不足：①Rg1浓度、剂量单一，Rg1的保护作用是否为剂量和浓度依赖性仍需进一步探究；②给药方式单一，血视网膜屏障可阻挡一部分Rg1进入视网膜，从而削弱药效，下一阶段的实验应补充玻璃体内注射等局部给药方式；③本研究为动物性实验，在生理结构及药物体内代谢方面与人体存在一定差异，是否适用于人体有待进一步探究。

综上所述，人参皂苷Rg1对大鼠视神经损伤性疾病有明显保护作用，显著减缓RGCs的凋亡速度，其机制可能与影响SIRT1和HMGCR基因的蛋白表达有关。

[参考文献]

[1] 王璐，苏绍波，柳夏林.大鼠视神经损伤后Toll样受体4在视网膜中的表达[J].中华实验眼科杂志，2013，32（11）：1045-1049.

[2] 梁庆丰，刘旭阳.北京眼压与颅压相关疾病研究中跨筛板压力差致青光眼视神经损伤的机制[J].中华眼科杂志，2014，50（10）：798-800.

[3] 于静.中医睫状体平坦部滤过术降眼压疗效安全性及其视神经保护作用研究[D].北京：中国中医科学院，2011.

[4] 王冬梅，吴玲玲，王艺，等.雷公藤甲素在慢性青光眼大鼠模型中对视网膜神经节细胞的保护[J].中华实验眼科杂志，2011，29（5）：393-397.endprint

[5] 李剑颖.保护眼睛的方法与饮食[J].中华养生保健，2013（7）：22-24.

[6] 寇宁，聂亚飞，朱晓莉.中药对原发性青光眼患者视力和视野的保护作用[J].中国中医眼科杂志，2003，13（3）：155-156.

[7] 张俊琦，胡丽荣，刘太平，等.氨基胍在兔视神经损伤后视网膜病理学变化中的作用[J].医学研究生学报，2013， 26（10）：1028-1031.

[8] 郑嵩山，卜战云，王应飞.大鼠视神经再生的组织病理学机制[J].眼科研究，2010，28（8）：716-719.

[9] 刘诗亮，陈媛媛，胡单萍，等.N-甲基-D-天冬氨酸诱导的正常眼压青光眼小鼠模型的实验研究[J].武汉大学学报：医学版，2014，35（5）：710-715.

[10] Wang Q，Sun LH，Jia W，et al. Comparison of ginsenosides Rg1 and Rb1 for their effects on improving scopolamine-induced learning and memory impairment in mice [J]. Phytother Res，2010，24（12）：1748-1754.

[11] 姚宝群.内皮祖细胞在高眼压视神经损伤修复中作用的初步研究[D].天津：天津医科大学，2012.

[12] Li CP，Zhang MS，Liu J，et al. Research of anti-aging mec?hanism of ginsenoside Rg1 on brain [J]. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi，2014，39（22）：4442.

[13] Sun ZG，Chen LP，Wang FW，et al. Protective effects of ginsenoside Rg1 against hydrogen peroxide-induced injury in human neuroblastoma cells [J]. Neural Regeneration Res?earch，2016，11（7）：1159-1164.

[14] 苏菲.人参皂苷Rg1和Re通过TLR4通路发挥免疫调节及抗内毒素作用[D].杭州：浙江大学，2015.

[15] 邬伟，杨景全，何志勇，等.人参皂苷Rg1联合骨髓间充质干细胞移植对痴呆大鼠学习记忆能力的影响[J].中国中西医结合杂志，2011，31（6）：799-802.

[16] 郭小东，刘洁，胡文，等.人参皂甙Rg1激活RGC-5细胞Akt信号通路拮抗谷氨酸兴奋毒性的实验研究[J].中国实用眼科杂志，2013，31（8）：1072-1076.

[17] 杨璐萌.人参皂苷Rg1延长C57BL/6J小鼠壽命及延缓脑老化的机制研究[D].福州：福建医科大学，2013.

[18] 彭彬.人参皂苷Rg1延缓神经干细胞衰老作用及机理研究[D].重庆：重庆医科大学，2011.

[19] 方庆，陆卫华，赵智刚，等.人参皂苷Rg1对大鼠视网膜神经节细胞的保护作用[J].实用医学杂志，2011，27（9）：1548-1550.

[20] 曹妍群，黄凯，罗特坚.人参皂苷Rg1对视网膜氧化应激损伤的保护作用[J].神经解剖学杂志，2015，31（4）：515-519.

[21] 黄丽娜，李诺.人参皂苷Rg1、白蒺藜皂苷、注射用鼠神经生长因子三种药物对NMDA诱导的大鼠原代视网膜神经节细胞损伤的保护作用[C]//中国第二届国际眼科学术研讨会论文汇编，2014.

[22] 李诺.新型视神经保护药物局部给药系统的实验研究[D].武汉：湖北中医药大学，2014.

[23] 张燕，李红阳，曹咏梅.沉默信息调节因子1调控胆固醇合成对大鼠视神经损伤后RGCs修复的作用机制[J].国际眼科杂志，2014，14（10）：1760-1764.

（收稿日期：2017-09-13 本文编辑：张瑜杰）endprint