辛伐他汀预处理保护大鼠脑缺血再灌注损伤分析

杨艺敏+刘忠民

[摘要] 目的 研究辛伐他汀预处理保护大脑脑缺血再灌注损伤。方法 选择2016年10月—2017年5月在该院观察的30只健康的雄性大鼠作为该文的研究对象，将大鼠随机分为3组，每组10只大鼠，分别为辛伐他汀预处理组（A组）、模型加溶媒组（B组）和假手术组（C组），使用线栓法制作大鼠大脑动脉缺血再灌注模型，并且进行2 h的再灌注，24 h之后对大鼠的神经功能进行评分，并且将大鼠断头取脑，对大鼠的凋亡细胞数、脑梗死体积和Fas表达进行测定。 结果 B组大鼠的脑梗死体积为（36.2±54.20）%，A组大鼠的脑梗死体积为（23.2±37.50）%，和B组相比，A组的脑梗死体积有明显的缩小；B组的神经功能缺损为（2.80±0.42）分，A组的神经功能缺损为（1.62±0.23）分，A组神经功能缺损评分比B组的改善明显，数据差异有统计学意义（P<0.05）；A组、B组的Fas表达分别为（31.25±2.65）%、（65.25±4.25）%，A组和B组的凋亡细胞数量为（30.21±3.14）%、（44.26±4.12）%，以此表示A组脑组织Fas表达和凋亡的细胞数量比B组降低明显，数据差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 辛伐他汀能够保护大鼠脑缺血再灌注的损伤，通过对脑组织Fas表达的抑制降低细胞的凋亡。

[关键词] 辛伐他汀；预处理；大鼠；脑缺血再灌注；损伤

[中图分类号] R743 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）12（b）-0045-03

[Abstract] Objective To study the simvastatin pretreatment in protecting the cerebral ischemia reperfusion injury in rats. Methods 30 cases of healthy male rats observed in our department from October 2016 to May 2017 were selected as the research objects and randomly divided into three groups with 10 cases in each， including the simvastatin pretreatment group （A group）， model and solution medium group（B group） and sham-operation group （C group）， and the cerebral artery ischemia reperfusion model of rats was made by the suture-occluded method for two-hour reperfusion， and the nerve function was marked after 24 h， and the number of apoptotic cells， cerebral infarct volume and Fas expression of rats were measured. Results The cerebral infarct volume in the group A was obviously shortened compared with that in the group B， [（23.2±37.50）% vs （36.2±54.20）%]， and the nerve function defect in the group A was obviously improved compared with that in the group B， [（1.62±0.23）points vs （2.80±0.42）points]， and the difference was statically significant（P<0.05）， and the Fas expression in the group A and in the group B was respectively （31.25±2.65）% and （65.25±4.25）%， and the number of apoptotic cell in the group A and in the group B was respectively （30.21±3.14）% and （44.26±4.12）%， therefore， the Fas expression and number of apoptotic cells in the group A obviously decreased compared with those in the group B， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion The simvastatin can protect the cerebral ischemia reperfusion injury in rats， and it can reduce the cell apoptosis by restraining the Fas expression of cerebral tissues.

[Key words] Simvastatin； Pretreatment； Rat； Cerebral ischemia reperfusion； Injury

腦血管病属于导致人类死亡的三大疾病，全球每年都有五百万人因为脑血管病死亡，尤其是在工业化国家中，患病和死亡人群的都在65岁以上。我国也是脑卒中死亡率较高的国家， 每年都有上百万人因为此病死亡，部分幸存者也会留下偏瘫等一系列的后遗症，从而丧失劳动能力及生活能力。缺血性脑卒中占据了脑血管病的85%，所以就要重视脑梗死的防治，以此实现受损神经细胞功能的恢复，这方面的研究一直以来都是医学界所关注的热点[1]。在现代溶栓技术不断发展的过程中，血管再通能够使脑组织重新得到血液，降低了神经元的损伤，有效提高临床疗效。但是因为具有在灌注损伤，在血液供应恢复的过程中细胞还是会走向死亡[2-3]。他汀类药物属于羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，在临床中应用能够对心血管疾病患者进行治疗，在对他汀类药物研究过程中表示，其不仅能够降脂，还能够实现神经保护的作用，比如抗血栓、血管内皮细胞保护、降低炎性反应等[4]。2016年10月—2017年5月该文拟使用大鼠脑缺血再灌注模型，观察辛伐他汀预处理对脑血管再灌注损伤的保护作用。endprint

1 材料与方法

1.1 药物及试剂

辛伐他汀片；氯化三苯基四氮锉粉剂（sigma）；Fas抗体；免疫组化染色试剂；显色剂。该实验的主要仪器包括沈阳市龙首电子仪器有限公司的病理组织脱水机；上海跃进医疗器械厂的电热恒温培养箱；成都泰盟科技有限公司的医学图像分析系统；唐辰电子提供的病理组织包埋机；OLYMPUS提供的光学显微镜。

1.2 动物和分组

该文选择30只健康雄性大鼠作为观察对象，所有大鼠均为陕西医科大学实验动物中心所提供，大鼠的体重在250～300 g之间，将所有的大鼠随机分为3组，分别为辛伐他汀预处理组（A组）、模型加溶媒组（B组）和假手术组（C组），每组10只大鼠。

1.3 给药方式

使用生理盐水将辛伐他汀药物制作成为悬浮液，在大鼠手术之前10 d根据大鼠的体重20 mg/kg进行灌胃，每天如此，为B组大鼠给予同样体积的生理盐水。

1.4 制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型

在大鼠连续灌胃10 d之后的第11天，使用线栓法制作大鼠大脑动脉缺血再灌注模型，并且进行2 h的再灌注，一共灌注24 h。使用水合氯醛10%腹腔灌注将大鼠进行麻醉，将右颈总动脉分离并且剪下一个小口，将0.215 mm直径的尼龙绳头端烧成光滑的杵杆桩插入到大鼠体内，计算颈总动脉分叉处的进线深度，结果为（18.0±0.5）mm，直到大脑中的动脉起始处能够将血供完全的阻断。再灌注的时候向外拉尼龙线，从而使大鼠颈内及大脑中的动脉血液供应能够恢复，如果大鼠的右眼出现Horner征、在提尾的时候大鼠左前肢内收屈伸、爬行的时候向左侧倾倒，或者爬行的时候根据逆时针的方向转圈，就表示模型创建成功。C组大鼠不需要插入线栓，其他操作都和以上操作步骤相同[5]。

1.5 神经功能的评定

根据前人研究方法在大鼠再灌注手术清醒时候对大鼠进行神经功能的评分：没有明显的神经功能缺损为0分；不能够伸展左侧前肢为1分，行走时候向左侧旋转为2分，行走的时候向左侧倾斜为3分；丧失意识，不能够自己行走为4分。排除0分和2分大鼠。

1.6 制作标本

在制作模型成功之后再灌注甲醛溶液4%对大鼠进行心脏灌流固定之后断头取脑，自视交叉之后向前向后分别去取 2.5 mm左右的冠状脑片，对其固定之后脱水透明，使用石蜡包埋，连续切片实现染色免疫组化。

1.7 功能的检测检测

免疫组织化学检测根据试剂盒中的说明书实现，Fas免疫阳性细胞膜及细胞质为棕黄色或者棕褐色。通过光镜检测细胞凋亡，如果神经元胞膜及胞质具有棕黄色的颗粒，表示为阳性，在阳性细胞分布区随意选择五个不重复的高倍镜视野，将每个视野中的阳性细胞数量作为 计算凋亡的指标从而对阳性细胞百分比进行计算。

在手术24 h之后对大鼠进行麻醉断头取脑迅速将其放置到-20℃的冰箱中进行保存10 min，将小脑、嗅球及低位脑干进行去除，其他部分进行冠状位切片，从额极向后以2 mm进行切片，一共5片，之后将脑片迅速放入到TTC溶液中避光，之后在37℃中进行30 min的孵育，在孵育之后使用数码相机照相，在计算机中输入染色的结果，通过图像处理软件对各个脑片缺血侧的面积及梗死区域体积进行计算[6]。

1.8 统计方法

该文数据均使用SPSS 18.0统计学软件进行处理，计量资料使用（x±s）表示，使用t进行检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑梗死、神经功能缺损的对比

表1为3组大鼠脑梗死体积和神经功能缺损的对比，以此表示C组大鼠通过染色之后的脑片全红，B组大鼠顶叶、右侧额和纹状体都有明显的白色梗死灶，A组大鼠的脑梗死体积有明显的缩小，并且神经功能缺损评分情况改善明显，优于其他两组，数据差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 3组大鼠辛伐他汀预处理与Fas表达

表2為3组大鼠辛伐他汀预处理和Fas表达的关系，以此表示A组大鼠比其他两组的Fas表达具有明显的增强，差异有统计学意义（P<0.05），并且脑组织Fas表达和凋亡的细胞数量降低，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

缺血性卒中是因为多种原因导致的脑部血液供应障碍，从而导致脑部组织出现不可逆的损害，以此导致出现脑组织缺血和缺血缺氧性坏死。在脑组织损伤之后应该得到恢复，但是因为血流无法超过再灌注时间窗，以此出现了更加严重的脑机能障碍，就是脑缺血再灌注损伤，从而扩大梗死病灶。脑缺血再灌注损伤属于较为复杂的级联反应，其中包括多个环节，比如酸中毒、能量障碍、神经细胞内钙超载、凋亡基因激活等等，从而成为恶性循环，使细胞凋亡或者坏死。缺血性脑卒中属于人们常见的脑血管疾病，其多发部位为大脑中动脉供血区域。该文使用大鼠实现动脉闭塞模型的主要原因是因为大鼠脑血管解剖的特点和人类较为相似，都是通过颈内动脉及椎基底动脉系统构成，并且其脑体积大小适中，具有良好的实验重复性，便于组织生化的分析。目前，大鼠大脑中动脉闭塞模型得到了良好的发展，成为现代脑缺血损伤病理生理改变的研究和治疗药物筛选的有效手段[7]。

脑缺血再灌注之后，Fas蛋白阳性细胞的数量不断的增加，尤其是缺血周围更加明显，并且其分布较为广泛，包括海马神经细胞、皮质及神经胶质细胞，如果Fas在胞膜及胞浆中表达，表示其导致出现脑缺血后细胞的凋亡。相关研究表示，两组鼠在缺血24 h之后都会出现神经元凋亡的现象，但是Fas基因突变大鼠的脑梗死面积较小。Fas利用水解实现细胞骨架调节蛋白催化及调节的结构分离，对调节的功能造成影响，导致细胞骨架塌陷[8]。

在该文研究中，C组大鼠Fas表达较少，B组大鼠比C组要强，数据差异有统计学意义（P<0.05），并且表达主要在缺血周围。A组表达降低，和B组相比差异有统计学意义，但是比C组差异较大，这和王欢欢[8]的研究结果相一致，这是因为Fas通过水解能够分离 细胞骨架调节蛋白催化结构。该实验还发现A组凋亡细胞率降低，这有可能和Fas表达降低相关，以此降低脑梗死体积，对神经功能评分进行改善，以此保护大脑。辛伐他汀预处理能够保护再灌注损伤，这和Fas降低和抗细胞凋亡有关。

综上所述，辛伐他汀能够保护大鼠脑缺血再灌注的损伤，通过对脑组织Fas表达的抑制降低细胞的凋亡，值得临床推广使用。

[参考文献]

[1] 王欢欢， 薛茜， 邹玉安，等.脑缺血预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国临床药理学杂志，2017，33（8）：699-702.

[2] 叶涛， 朱路文， 唐强，等.电针预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能和缺血半暗区Tolls样受体4、核转录因子κB蛋白的影响[J].中国康复理论与实践， 2017，23（7）：745-749.

[3] 邓红， 丁永永， 彭捷，等.依托咪酯对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制[J].华西药学杂志，2017，32（4）：381-384.

[4] 叶涛， 朱路文， 唐强，等. 电针预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后脑梗死体积及血清TNF-α、IL-10含量的影响[J]. 中国针灸， 2017（10）：1093-1098.

[5] 韩春辉.依达拉奉对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用研究[J].中外医疗，2015，34（15）：114-115.

[6] 张婧，邹玉安，董晓华，等.缺血预处理降低脑缺血再灌注损伤及TLR4、TNF-αmRNA的表达[J].河北北方学院学报：自然科学版，2017，33（4）.

[7] 薛晶， 李丽， 李淞，等. 蛋白酶体抑制剂万珂对脑缺血再灌注损伤保护作用机制的研究[J].中外医疗，2015，34（18）：95-96.

[8] 王欢欢， 薛茜， 邹玉安，等. 脑缺血预处理对大鼠缺血再灌注损伤后抗氧化应激通路的影响[J].中华老年心脑血管病杂志， 2017， 19（1）：78-82.

（收稿日期：2017-09-15）endprint