基于耐缺氧能力检测的心脑宁胶囊质量控制方法研究
2018-03-07郭婷董永喜何峰黄家宇董莉
郭婷+董永喜+何峰+黄家宇+董莉
[摘要] 目的 建立可用于心脑宁胶囊质量控制的生物活性测定方法。方法 该次研究地点为贵州医科大学药学院,于2016年9月—2017年4月选择健康昆明KM小鼠随机分为6组,每组10只,即正常组、盐酸异丙肾上腺素模型组、盐酸川芎嗪阳性药组以及心脑宁胶囊高、中、低剂量组。皮下注射盐酸异丙肾上腺素 建立心肌缺氧模型(正常组注射生理盐水)后,小鼠分别给予药物盐酸川芎嗪以及不同剂量的心脑宁胶囊,测定存活时间。并测定12批心脑宁胶囊的生物活性。结果 与模型组比较,心脑宁胶囊以0.68 g/kg、1.35 g/kg剂量给药3 d后,可显著增加缺氧小鼠的存活时间(P<0.05) ,分别增加21.42%、25.31%;且12批样品均具有较好的生物活性,使小鼠存活时间增加24.74%以上(P<0.05)。結论 基于耐缺氧能力的心脑宁胶囊生物活性测定方法准确、可靠,能有效控制心脑宁胶囊的内在质量。
[关键词] 心脑宁胶囊;耐缺氧能力;生物活性测定;质量控制
[中图分类号] R286 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2017)12(b)-0012-04
[Abstract] Objective To establish the measurement method of biology activity of quality control of xinnaonign capsules. Methods 10 healthy Kunming KM mice in 6 group in our hospital from September 2016 to April 2017 were selected, including the normal group, isoproterenol hydrochloride mode group, and Ligustrazine Hydrochloride positive drug group and high-dose, moderate-dose and low-dose xinnaoning capsules group, and the mice was respectively given the ligustrazine hydrochloride and different doses of xinnaoning capsules after establishing the myocardial anoxia modes (injection of normal saline in the normal group), and the survival time was measured, and the biology activities of 12 batches of xinnaoning capsules was measured. Results The administration of xinnaoning capsules of 0.68 g/kg and 1.35 g/kg for three days can obviously increase the survival time of hypoxia mice compared with that in the mode group(P<0.05), and the increase values were respectively 21.42% and 25.31%, and 12 batches of samples had better biology activity, thus increasing the survival time of mice by more than 24.74%(P<0.05). Conclusion The xinnaoning capsule based on the hypoxia-resistance ability test is accurate and reliable, which can effectively control the internal quality of xinnaoning capsules.
[Key words] Xinnaoning capsules; Hypoxia tolerance; Biochemical activity measurement; Quality control
心脑宁胶囊是治疗心血管疾病的常用中药复方制剂,由银杏叶、小叶黄杨等配伍组成的,主要用于治疗气滞血瘀的胸痹,头痛,眩晕,症见:胸闷刺痛,心悸不宁,头晕目眩等,以及冠心病、脑动脉硬化见上述症状者[1-3]。临床疗效显著,受到广大医生和患者的欢迎。心脑宁胶囊在2015 年版《中国药典》一部中的现行质量标准主要采用理化分析方法,对总黄酮醇苷和丹酚酸B进行含量测定,难以全面反映制剂的生物活性。中药的生物活性是直接测定药物有效性,是中药质量控制中现有理化测定方法所不能替代的,近年来成为了中药质量控制的热点[4-5]。目前心脑宁胶囊的质量控制以薄层色谱定性鉴别和含量测定为主[6-7],缺乏以生物活性为指导的质量控制方法,因此该实验于2016年9月—2017年4月选择健康KM小鼠60只选择小鼠耐缺氧实验对心脑宁胶囊进行生物活性测定方法的研究,建立其生物活性测定方法以控制产品的质量。
1 资料与方法
1.1 试剂与试药
心脑宁胶囊(批号20141012),钠石灰(批号2015 0618),盐酸异丙肾上腺素注射液(ISO,批号20151102),注射用盐酸川芎嗪(批号13090529)。
1.2 试验动物
健康KM小鼠,18~22 g,雌雄各半,由贵州医科大学实验动物中心提供(合格证号SCXK(黔)2012-0001)。endprint
1.3 心脑宁胶囊对小鼠常压耐缺氧能力限值剂量的研究
小鼠60只,雌雄各半,体重18~22 g。随即分为6组,每组10只,分别为对照组、ISO模型组(15 mg/kg)、盐酸川芎嗪组(40 mg/kg)、心脑宁胶囊高、中、低剂量组(1.35、0.68、0.34 g/kg),小鼠每天上午9:00灌胃给药3 d,末次给药后1 h,各组小鼠以15 mg/kg ISO皮下注射(正常组注射生理盐水), 20 min后,分测定小鼠存活时间并计算其增加率[8]。
1.4 重复性实验
取心脑宁胶囊以1.35 g/kg剂量给药,按1.3项下方法进行6次平行测定试验,计算小鼠存活时间增加率。
1.5 中间精密度
1.5.1 不同實验人员 对6 名实验人员进行编号,称取心脑宁胶囊6份均以1.35 g/kg剂量给药,按1.3项下方法进行测定,计算小鼠存活时间增加率。
1.5.2 不同工作日(日间精密度) 称取心脑宁胶囊6份均以1.35 g/kg剂量给药,于第1天、第2天……第6天分别给药,按1.3项下方法进行测定,计算小鼠存活时间增加率。
1.6 不同批次心脑宁胶囊生物活性的测定
分别取不同批号的12批心脑宁胶囊(1.35 g/kg),按1.3项下方法进行测定,计算小鼠存活时间增加率。
1.7 统计方法
采用 SPSS 18.0统计学软件进行统计分析,计量结果以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用ANOVA分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 限值剂量研究
表1结果表明,与正常组比较,ISO模型组小鼠的存活时间显著降低(P<0.05)。与模型组比较,心脑宁胶囊以剂量0.68 g/kg、1.35 g/kg给药3 d可明显增加小鼠的存活时间(P<0.05),分别增加21.42%、25.31%。为保证实验的可靠性和重复性,后期实验中选用1.35g/kg剂量作为限值剂量进行试验。
2.2 重复性实验
同一样品平行测定6次的结果,与模型组比较,心脑宁胶囊(1.35 g/kg)均可显著增加小鼠的存活时间(P<0.05),增加率为22.71%~29.46%,表明重复性较好,见表2。
2.3 中间精密度
2.3.1 不同实验人员 实验室内不同的6 名实验人员以1.35 g/kg心脑宁胶囊给药3 d后进行测定,与模型组比较,心脑宁胶囊均可显著增加小鼠的存活时间(P<0.05),增加率为25.35%~31.08%,表明不同实验人员之间的中间精密度良好,见表3。
2.3.2 不同工作日(日间精密度) 按1.3项下方法,于第1天、第2天……第6天分别给药心脑宁胶囊后进行测定,与模型组比较,6次试验均可显著增加小鼠的存活时间(P<0.05),增加率为22.39%~30.04%,表明方法的日间精密度良好。见表4。
2.4 不同批次心脑宁胶囊的生物活性测定
不同批号的12批样品测定结果,与模型组比较,心脑宁胶囊均可显著增加小鼠的存活时间(P<0.05),使小鼠存活时间增加24.74%以上,表明该方法适用性较好,见表5、表6。
3 讨论
由于中药成分复杂、来源多区域、有效成分不明确等特点,以薄层色谱鉴别、含量测定以及和指纹图谱为主的现有质量标准就无法控制其药效,具有一定的局限性[9]。因此要保证中药药效,应增加以有效性为目的的质量控制方法,以达到中药质量可控的目的[10-11]。而以直接测定药物的有效性的生物活性测定法,体现了在中药质量控制中的优势,2010年版和2015年版《中国药典》也已经增加了《中药生物活性测定指导原则》,充分体现了生物活性测定已经成为了中药质量控制中的作用[11-14]。芮菁等[15]以30 mL/kg的剂量采用小鼠体内血栓形成、大鼠血小板聚集、小鼠急性脑缺血试验建立了灯盏细辛注射液生物活性的测定方法,潘善庆等[16]以10 mL/kg的剂量采用CCl4肝损伤小鼠建立了立肝炎灵注射液生物活性的测定方法。
盐酸异丙肾上腺素注射液是儿茶酚胺类物质,为β受体激动剂,使心肌耗氧量明显;而其诱导的心肌缺氧模型由于其易于操作、稳定可靠,在心血管疾病研究中为经典的实验。因此,本试验采用该经典方法以复制小鼠心肌缺氧缺血模型[8]。
在实验中,选择具有活血化瘀功能的川芎嗪作为阳性药,实验结果显示,与模型组比较,心脑宁胶囊以0.68 g/kg、1.35 g/kg剂量给药3 d后,可显著增加缺氧小鼠的存活时间(P<0.05) ,分别增加21.42%、25.31%。并根据《中药生物活性测定指导原则》进行了方法学验证,且12批样品均具有较好的生物活性,使小鼠存活时间增加24.74%以上(P<0.05),结果表明该法操作简单灵敏度高、重复性好,可用于心脑宁胶囊质量控制的生物活性测定。
随着研究的深入,如今已应用生物活性测定来评价中药的质量,如采用部分凝血酶时间法测定水蛭的抗凝活性[17]、抑菌圈检测法测定扶正消积胶囊的抗菌效价[18]、管碟法测定双黄连口服液的抗菌效价[19]。生物活性测定法作为对现有质量标准的一个补充完善,将会有更多的研究报道以使其得到更好的推广应用。
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(收稿日期:2017-09-14)endprint