ATF3在散发性单纯性尿道下裂患者包皮组织中的表达及意义

许雅丽+陈兴和+李笃妙

[摘要] 目的 檢测散发性单纯性尿道下裂患者包皮组织中激活转录因子3（ Activating transcription factor 3， ATF3）的表达情况，探索ATF3与散发性单纯性尿道下裂之间的关系。方法 方便选择2014年1月—2017年1月该院收治的散发性单纯性尿道下裂患者在尿道成形术中切除的包皮组织（共35例，其中轻度10例，中度15例，重度10例）作为尿道下裂组样品，单纯包皮过长（含包茎）患者在包皮环切术中去除的多余的包皮组织（共20例）作为对照组样品。通过RT-PCR方法检测实验组和对照组ATF3 mRNA 的表达情况。采用 SPSS 12.0统计学软件进行数据录入，构建数据库。结果 通过RT-PCR方法测得散发性单纯性尿道下裂患者包皮组织中 ATF3 mRNA 的相对表达量为：（0.54±0.06），对照组的包皮组织中ATF3 mRNA的相对表达量为：（0.44±0.07），从结果中可以得出在散发性单纯性尿道下裂患者的包皮组织中ATF3的表达情况比正常的尿道组织中明显增加，两组结果比较， 差异有统计学意义（t=5.89，P=0.00）。比较不同严重程度中尿道下裂患者ATF3 mRNA相对表达量，不同严重程度相对表达量差异无统计学意义（F=0.13，P=0.88）。结论 散发性单纯性尿道下裂患者中ATF3的表达水平明显高于正常对照组，这提示ATF3与散发性单纯性尿道下裂存在着密切的关系。为将来研究ATF3在尿道下裂中产生的相关信号转导通路提供相关实验基础，及研究尿道下裂的发病机制提供理论依据。

[关键词] 尿道下裂；ATF3；包皮组织

[中图分类号] R726 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）12（b）-0005-05

[Abstract] Objective To test the expression of ATF3 in the prepuce tissue of patients with sporadic isolated hypospadias and explore the correlation between the ATF3 and sporadic isolated hypospadias. Methods The prepuce tissues of 35 cases of patients with sporadic isolated hypospadias removed in urethroplasty admitted and treated in our hospital from January 2014 to January 2017 were convenient selected （10 mild， 15 moderate， 10 severe），were selected as the hypospadias group， while the redundant prepuce tissues of 20 cases of patients with simple redundant prepuce （including phimosis） in the circumcision were selected as the control group， and the expression of ATF3mRNA of the two groups was tested by the RT-PCR method， and the data were recorded by the SPSS 12.0 statistical software， and the database was constructed. Results The relative expression of ATF3 mRNA in the prepuce tissue of patients with sporadic isolated hypospadias by the RT-PCR method was （0.54±0.06）， and the relative expression of ATF3 mRNA in the control group was （0.44±0.07）， and the results showed that the expression of ATF3 in the prepuce tissues obviously increased compared with that of the normal urethra tissues， and the difference was statistically significant， （t=5.89， P=0.00）， and the difference in the relative expression of ATF3mRNA of different severity was not obvious （F=0.13， P=0.88）. Conclusion The expression level of ATF3 of patients with sporadic isolated hypospadias was obviously higher than that in the normal control group， which reminds that ATF3 has a close correlation with the sporadic isolated hypospadias， and it can provide related experimental basis for the study of the signal transduction pathway produced by ATF3 in the hypospadias and provide theoretical basis for the study of the pathogenesis of hypospadias.endprint

[Key words] Hypospadias； ATF3； Prepuce tissue

尿道下裂是儿科临床中最常见的泌尿生殖系统先天性畸形疾病。最近的流行病学调查研究显示，其发生率在许多国家和地区现已持续上升[1]。临床上根据尿道口开口的位置不同，常将尿道下裂分为：远端型（轻度，包括龟头型、冠状沟型）、中段型（中度，包括阴茎体远端型、阴茎体型、阴茎体近端型）、近端型（重度，包括阴茎阴囊交界型、阴囊型、会阴型）[2]。男性尿道的发育是一个涉及多基因编码、细胞分化、激素信号转导、酶活性以及组织更新等一系列非常复杂的过程[3]。近年来，转录激活因子家族的ATF3（Activating transcription factor 3，激活转录因子 3）成为先天性尿道下裂发病机制研究的焦点，被认为是先天性尿道下裂病因中的一个关键的调控基因[4]。该实验采用RT-PCR技术在RNA水平探讨了2014年1月—2017年1月期间该院收治的35例散发性单纯性尿道下裂患者包皮组织中ATF3表达水平与散发性单纯性尿道下裂之间的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

实验对象为方便选取在该院住院的散发性单纯性尿道下裂患者共35例（轻度尿道下裂10例，中度尿道下裂15例，重度尿道下裂10例），平均年龄5.3（3～12）岁，且经诊断未合并其他疾病。对照组为20例单纯包皮过长（含包茎）患者在包皮环切术中去除的多余的包皮组织，平均年龄6（3～14）岁。两组患者一般资料相比，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 实验对象入选标准和匹配

1.2.1 纳入标准 ①尿道下裂组：临床确诊为单纯性尿道下裂疾病；尿道下裂散发性患者，不呈现出地区聚集性；不伴有其他的泌尿生殖系统疾病；病患家属签署《知情同意书》，自愿参与该项课题研究。②对照组：对照组共20例，单纯包皮过长的患者不伴有其它畸形或疾病，患者家属签署《知情同意书》，自愿参与该项课题研究。

1.2.2 匹配 尿道下裂组和对照组基本情况的匹配，根据尿道下裂组患者一般人口学情况，对照组患者进行了年龄的适当匹配，两组人群构成总体一致。

1.3 实验试剂与设备

TRIzol试剂、盒装tip头（上海生工，中国）、氯仿、异丙醇、逆转录试剂盒（杭州主诺生物技术有限公司，中国）、全部PCR引物（上海生工，中国）、兔抗人激活转录因子 ATF3抗体 P3 571Rb-h（上海羲森生物科技有限公司）、SP-9 000免疫组化染色试剂盒和DAB显色剂（上海科兴贸易有限公司）PE2 400型PCR扩增仪（河南新乡优科仪器商行）JY-ECP3 000型高压电泳仪（北京维欣仪奥科技发展有限公司）Gel Doc-It 310 Imaging System凝胶成像系统（赛百奥科技）Gel Doc2000 凝胶扫描仪（BIO-RAD，美国）

1.4 实验方法

1.4.1 获取组织和冷藏 将手术中切除的包皮组织，用液氮冷冻，并保存在液氮罐中备用。

1.4.2 Trizol 法提取包皮组织中总RNA 采用TRIzol法提取组织中的总RNA。经过组织匀浆化作用、分离阶段、RNA沉淀、RNA洗脱和再溶解，最后对所提取的RNA质量进行检测。

1.4.3 逆转录（RT）和PCR反应产物的分析 逆转录主要采用逆转录试剂盒进行。配置好的琼脂糖凝胶放入电泳槽中，电泳1.5 h后紫外灯检测，凝胶密度扫描找寻核酸染液染色的特异性条带。具体方法如下。

①设计ATF3和GAPDH（内参基因）的PCR引物。

GADPH基因引物（280 bp）：

上游5`CATGGGTGTGAACCATGAGAAGT`3

下游5`GTTCAGCTCAGGGATGACCTTG`3，

ATF3 基因引物（218 bp）：

上游5`TCGGGGTGTCCATCA-CAAAAGC`3

下游5`CTTCTCGTTCTTGAGCTCCTCAATC`3，

②采用常规Trizol法提取组织总RNA，于-80℃保存待用。琼脂糖凝胶电泳检测 RNA ，并用theomo酶标仪检测RNA浓度，严格按照逆转录试剂盒（Promega 公司）操作步骤合成 cDNA。

③PCR具体包括如下5个步骤。

第1步，各RNA 模板均设置無逆转录对照组，同时，各 PCR 体系均设置阴性对照组，每个样本设置3个复孔。第2步，反应体系与条件： 总反应体系为 20 μL， 30个循环：（95℃变性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s），4℃终止反应。第3步，PCR反应管同时加入 ATF3 和GAPDH 的上下游引物，扩增 ATF3 和 GAPDH 基因片断。第4步，2% 琼脂糖凝胶，85 V，电泳1.5 h，观察电泳条带。第5步，拍照，并计算 ATF3 mRNA 的相对含量= OD值（ATF3）/OD 值（GAPDH）。

1.5 统计方法

实验过程中采集的数据均进行了严格检查，重复测量将偏出均值3个标准差的数据进行删除。采用SPSS 12.0统计学软件进行数据录入，构建数据库。计量资料使用（x±s）表示，采用F/t检验，计数资料用（%）表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验对象一般人口学情况

收录调查对象共55例，于2014年1月—2017年1月期该院该院住院手术的尿道下裂患者和包皮过长（包括包茎）的患者。对尿道下裂组与对照组患者的年龄进行严格的匹配，所有患者年龄控制在14岁以内。尿道下裂组共35例，≤6岁23例（占65.7%），7～10岁10例（占28.6%），14岁以下2例（占5.7%）。正常包皮组≤6岁13人（占65.0%），7～10岁5人（占25.0%），14岁以下2人（占10.0%）。见表1。endprint

2.2 ATF3 mRNA测定结果

2.2.1 两组ATF3 mRNA相对表达量的比较 检测尿道下裂组35例和正常包皮组20人的包皮组织中 ATF3mRNA相对表达量，发现其中尿道下裂组 ATF3 m RNA测定结果0.39～0.64之间，平均（0.54±0.06）；正常包皮组ATF3 mRNA测定结果0.33～0.55之间，平均（0.44±0.07）。尿道下裂组ATF3 mRNA相对表达量明显高于正常包皮组（t=5.89，P=0.00）。具体见表2、图1。

2.2.2 不同严重程度尿道下裂患者ATF3 mRNA相对表达量的比较 ATF3 mRNA 的相对含量如下：轻度患者（0.53±0.06）、中度患者（0.54±0.06）、重度患者（0.54±0.43），不同严重程度相对表达量差异无统计学意义（F=0.13，P=0.88），见表3。

2.2.3 尿道下裂患者的尿道组织和正常组织包皮RNA电泳图谱结果 对尿道下裂组和正常包皮组患者样本组织进行扩电泳。左侧为100 bp的DNA Marker电泳图谱，第2道为阴性对照，第3和第4道为正常对照组，第5和第6道为尿道下裂组，见图2。

2.2.4 不同严重程度尿道下裂患者包皮组织RNA电泳图谱结果 再对不同严重程度尿道下裂患者组织标本中内参照GAPDH进行扩增电泳。左侧为100 bp的DNA Marker电泳图谱，第2道为阴性对照，第3道为正常对照组，第4～6道分别为重度尿道下裂患者、中度尿道下裂患者、轻度尿道下裂患者，见图3。

3 讨论

先天性尿道下裂的发生主要是由于胚胎早期受到各种因素的影响和作用，使尿道的海绵体融合过程发生了中断，管化过程发生了异常，前尿道发育不全从而导致了尿道的开口不能达到正常龟头最顶端的位置，出现尿道开口的异常，使其开口在阴茎腹侧、龟头至阴囊、会阴部的途径上。同时由于融合中断、管化异常的尿道海绵体发生了挛缩，形成阴茎腹侧纤维索带，牵拉而引起了阴茎变形弯曲，导致阴茎下弯曲。所以，尿道下裂的根本病变就是尿道组织表现（尿道海绵体和尿道板）的异常[5]。

ATF3是含亮氨酸拉链结构的活化转录因子，属于ATF/cAMP效应元件结合蛋白（ATF/CREB），为转录因ATF/CERB家族成员之一[6]。在大部分正常静息细胞中ATF3呈稳态表达，mRNA的基础水平非常低。既往研究表明：当细胞受到体内外损伤性压力信号刺激时，ATF3的mRNA水平显著的上升[7]。ATF3参与维持组织内环境稳定、损伤修复、细胞黏附及凋亡。在许多研究中证明ATF3的过表达会促进细胞凋亡，在动物模型试验中，ATF3在老鼠中过表达会导致心脏传导和收缩功能障碍[8]，在老鼠肝脏中过表达会导致肝脏功能障碍[9]等等。在动物模型中，很多病理性损伤可诱导组织细胞表达ATF3；在体外培养的细胞中，生长刺激因子、细胞因子、遗传毒性因子、病毒蛋白和信号分子等可诱导ATF3表达[10]。诱导信号不仅增加ATF3转录，还可以增强mRNA的水平与稳定性[11]。大量研究表明，ATF3可以根据靶基因和细胞环境的不同，激活或抑制相关基因表达，具有广泛的转录调节作用，许多学者们认为ATF3基因是先天性尿道下裂病因中的一个关键调控基因。在对330例尿道下裂的儿童患者及380例对照儿童外周血进行 SNPs序列测序的相关性分析与研究中，Beleza-Meireles 等[12]发现 ATF3 基因发生变异是尿道下裂的危险因素之一，ATF3基因變异可导致细胞的生存、死亡、应激等，在上皮及间质细胞之间引起的反应与尿道下裂的发生和发展存在着密切的关系。王勇等[13]在研究ATF3在糖皮质激素与邻苯二甲酸二丁酯联合作用致大鼠尿道下裂发生中的表达变化中发现，地塞米松联合邻苯二甲酸二丁酯进一步增强了邻苯二甲酸二丁酯的致畸作用，ATF3在对照组与实验组生殖结节中的表达有了明显的变化，且随着尿道下裂程度的加重而表达增高，ATF3的过表达影响了生殖结节的发育及尿生殖褶的融合，认为这可能是尿道下裂发生的机制之一。

为了进一步研究ATF3与散发的单纯性尿道下裂之间的关系，该实验通过RT-PCR的方法对35例散发性单纯性尿道下裂术中多余的包皮组织和正常包皮组织进行处理与测定，在RNA水平检测实验组和对照组之间存在的差异，从而推论ATF3 和散发性单纯性尿道下裂之间的关系。通过采用RT-PCR技术，再经凝胶电泳后进行图像分析，最终测得尿道下裂组 ATF3 mRNA的结果在0.39～0.64之间，平均（0.54±0.06）；而正常包皮组ATF3 mRNA的结果在0.33～0.55之间，平均（0.44±0.07）。尿道下裂的尿道组ATF3 mRNA相对表达量明显高于正常包皮组（t=5.89，P=0.00）。值得注意的是，在不同严重程度（轻度、中度和重度）尿道下裂患者中ATF3 mRNA相对表达量差异无统计学意义（F=0.13，P=0.88）。这与李远伟等[14]的研究结果相一致，该研究组测得尿道下裂患者ATF3 mRNA 的相对表达量为（0.5375±0.0591）， 对照组相对表达量为（0.4193± 0.0678）， 两组比较， 差异有统计学意义。也发现在正常人包皮组织中ATF3表达量很少，散发的单纯性尿道下裂患者包皮组织中ATF3的表达明显增多。通过该实验初步证实：转录因子 ATF3与散发性单纯性尿道下裂存在着密切的关系， ATF3有可能通过调节ATF3 相关的信号转导通路，或者调控尿道下裂相关基因的表达，从而导致患儿尿道下裂的发生、发展。因此，仍需要进一步研究ATF3的相关转导通路，以发现尿道下裂的发病机制，以期将来可在发病机制的层面进行干预，减少尿道下裂的发病率。

4 结论

散发性单纯性尿道下裂患者中ATF3的表达水平明显高于正常对照组，这提示ATF3与散发性单纯性尿道下裂存在着密切的关系。为将来研究ATF3在尿道下裂中产生的相关信号转导通路提供相关实验基础，及研究尿道下裂的发病机制提供理论依据。endprint

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（收稿日期：2017-09-12）endprint