斑马鱼肠道细菌的16S rDNA分子鉴定及PCR-SSCP分析

胡秀彩，吕爱军，孙敬锋，石洪玥，YEONG Yiksung，裴超，张超，李莉

(1.天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津300384；2.河南师范大学水产学院，河南新乡453007)

斑马鱼Danio rerio个体较小，性成熟期短，繁殖力强，胚胎透明且体外发育，易于活体观察，便于研究其遗传发育、生理病理和疾病免疫功能[1]。目前，斑马鱼已成为研究人类、动物和鱼类疾病的一种水生模式动物[1-2]。

鱼类肠道微生物是影响其生长发育等生命活动的重要因素之一。研究表明，鱼类肠道正常菌群在营养物质消化吸收、免疫反应和器官发育等方面具有重要作用，且影响鱼类的生长、发育、生理和病理[3-4]。目前，国内外对肠道微生物的研究主要集中在畜禽动物，而对鱼类肠道菌群组成的研究报道尚少[3-5]。对于鱼类肠道微生物群落结构的分析鉴定需要建立快速、准确的研究技术，其中单链构象多态性分析 (SSCP)是一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法[6]。而PCR-SSCP方法被广泛用于未知基因突变的检测，近年来在肠道微生物多样性的分析上也有应用[7-11]。为此，本试验中通过对斑马鱼肠道细菌进行分离纯化、16S rDNA基因克隆和V3区的PCR-SSCP等系统研究，揭示斑马鱼肠道细菌种类，旨在为探讨鱼类肠道菌群结构对其生命活动的影响提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用斑马鱼购自江苏省徐州市某花鸟市场。

LB固体培养基、LB液体培养基、4%NaCl嗜盐菌培养基由天津市水产生态及养殖重点实验室配制。

TCBS琼脂、SS琼脂、伊红美蓝EMB选择培养基购自杭州微生物试剂公司。UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒购自上海生工生物工程公司，dNTP、Taq DNA聚合酶、10×PCR反应试剂、PCR产物胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程公司，pMD 18-T载体购自大连宝生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 斑马鱼肠道细菌的分离与培养特性 参照胡秀彩等[5]的方法，在无菌条件下分别将菌落接种到 LB平板、4%NaCl营养琼脂、TCBS琼脂、SS琼脂、EMB选择培养基上，于29℃下倒置培养24 h。分别挑取菌落形态特征不同的单个菌落接种到LB平板上，无菌条件下挑取单菌落多次划线进行分离纯化。获得纯化细菌菌株于4℃下保存(试管斜面)。观察细菌在普通琼脂培养基与选择培养基上的生长情况，并记录菌体培养特性。

1.2.2 细菌基因组DNA提取及16S rDNA基因PCR扩增 根据斑马鱼肠道菌株在不同平板上的菌落形态、颜色、大小等，选取12株细菌进行16S rDNA序列测定，采用UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，经琼脂糖电泳后，将12株细菌的总DNA于-20℃下保存备用。采用大肠杆菌通用引物对16S rDNA进行扩增，正向引物序列为 5′AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3′， 反向引物序列为 5′TACGGTTACCTTGTTACGACTT 3′。 PCR反应体系 (共 15 μL)： 模板1.0 μL， 正、 反向引物各 0.5 μL， Taq PCR Master Mix 7.5 μL， 加 ddH2O 5.5 μL。 反应条件： 94 ℃下预变性4 min；94℃下变性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，共进行30个循环；最后在72℃下再延伸10 min，于4℃下保存备用。

将PCR产物连接pMD-18T载体，并转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，经pMD-18T载体 M13的正向引物序列 5′ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 3′、 反向引物序列 5′ATTACCGCGGCTGCTGG 3′进行PCR扩增，验证阳性克隆由上海生工生物工程有限公司测序。采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳，EB染色检测，用紫外线分析仪拍照观察。

1.2.3 16S rDNA序列及系统发育学分析 将测序获得的16S rDNA序列，利用NCBI进行BLAST序列比对 (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，基于16S rDNA序列分析，所获得序列与数据库中的参考序列应用CLUSTALX 1.8软件进行匹配比对，然后采用MEGA 4.1软件构建系统发育树。

1.2.4 16S rDNA基因V3序列的PCR-SSCP分析

以细菌总DNA为模板，用正向引物序列5′CAGTCACGACGTTGTAA 3′、 反 向 引 物 序 列5′CAGGAAACAGCTATGAC 3′扩增16S rDNA 序列。PCR反应体系 (共15 μL)：正、反向引物各0.5 μL， Buffer 1.5 μL， Mg2+0.6 μL， dNTP 0.2 μL，Taq 酶 0.1 μL， 模板 1.5 μL， 加 ddH2O 至 15 μL。反应条件：94℃下预变性4 min；94℃下变性30 s，51℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，共进行30个循环；最后在72℃下再延伸10 min，于4℃下保存备用。PCR扩增产物采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

SSCP分析依照文献[5-6]进行，简述如下：取6 μL的PCR产物和4 μL变性缓冲液混匀，98℃下变性10 min后立即冰浴10 min，于10%PAGE中电泳，4℃、180 V条件下电泳2.5 h(Bio-Rad)；电泳后先用蒸馏水洗1～2次，再用0.1%AgNO3染色15 min，最后利用2.0%NaOH(0.2%甲醛)显色，直至条带清晰为止，拍照进行SSCP带型分析。

2 结果与分析

2.1 斑马鱼肠道细菌形态及培养特征

从斑马鱼肠道中分离纯化出12株细菌，分别命名为 Zf1、 Zf2、 Zf3、 Zf4、 Zf5、 Zf6、 Zf7、 Zf8、Zf9、Zf10、Zf11和 Zf12，在 LB培养基培养24 h后12株分离细菌均为中小型菌落，多为透明或乳白色菌落。其中，菌株 Zf5、Zf6、Zf7、Zf8、Zf9在4%NaCl平板上生长缓慢，菌落形态小而圆、多为乳白色，其余7个菌株生长不良；菌株Zf1、Zf2、 Zf3、 Zf4分别在 TCBS、 TCBS、 EMB、 SS选择培养基上生长较快，并呈现出不同的颜色；菌株Zf10、Zf11和Zf12在LB培养基上生长较快，呈现为乳白色的圆形菌落 (表1)。

2.2 肠道菌株l6S rDNA基因克隆及分子鉴定

斑马鱼肠道细菌基因组总DNA电泳检测显示，12株细菌基因组DNA均大于2000 bp，可用作PCR扩增16S rDNA的模板 (图1)。

以所提取的细菌总DNA为模板进行16S rDNA PCR扩增，PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，表明扩增出Zf1～Zf12菌株的16S rDNA基因片段，大小约为1500 bp(图2)，用PCR检测pMD18-T/16S rDNA阳性克隆并进行测序。对斑马鱼肠道细菌测序获得的7个菌株的16S rDNA序列，利用NCBI进行BLAST序列相似性检索，结果见表2。同时结合肠道细菌形态学和培养特征，确定菌株Zf1与Zf11属于气单胞菌属Aeromonas，与菌株Aeromonas veronii为同一种细菌；Zf4与Zf8属于鞘氨醇单胞菌属 Sphingomonas，与菌株 Sphingomonas sp.为同一种菌；Zf5属于芽孢杆菌属Bacillus，与菌株Bacillus subtilis为同一种菌；Zf7属于气单胞菌属Aeromonas，与菌株Aeromonas sp.M10为同一种菌；而Zf10与非培养菌株uncultured bacterium clone GI3-M-5-G01为同一种菌，可能是一种新的菌种。

表1 细菌的形态和培养特征Tab.1 Morphological and culture characteristics of all strains

图1 菌株Zf1-Zf12基因组总DNAFig.1 Total DNA of genome from strains Zf1 to strain Zf12 in the intestine of zebrafish

图2 菌落PCR检测pMD18-T/16S rDNA阳性克隆Fig.2 Positive clones of pMD18-T/16S rDNA in the strains by PCR

表2 16S rDNA序列测序结果分析Tab.2 Sequencing of the 16S rDNA from different isolates

通过构建16S rDNA基因序列系统发育树分析显示，以Zf1、Zf11为代表的菌株与已知种的细菌Aeromonas veronii聚为一支，亲缘关系最近，归在同一类群，且一致性达99%；而菌株Zf5则与Bacillus subtilis聚为一支，一致性达99%；而以Zf4、Zf8为代表的菌株则与Sphingomonas sp.未知细菌聚为一支，归在同一类群，一致性达99%；Zf7与Aeromonas sp.未知细菌聚为一支，一致性达99%；另外一个代表菌株Zf10则与尚未获得纯培养的菌株聚为一支，一致性达92%。以肠道大肠埃希氏菌Escherichia cdi作为参考菌株，与各菌株分支较远，可知分离的菌种与大肠埃希氏菌亲缘关系较远(图3)。

图3 以斑马鱼肠道细菌16S rDNA基因序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree analysis of different bacterial isolates from the intestine of zebrafish based on 16S rDNA gene sequence

2.3 16S rDNA基因V3区的PCR-SSCP分析

对12株分离菌16S rDNA V3区基因的PCRSSCP图谱显示，斑马鱼肠道细菌Zf1～Zf12的16S rDNA V3区基因存在多态性：Zf1与Zf11带型一致；Zf4与Zf8带型一致；而Zf5、Zf7、Zf10带型各不相同，与前两种带型也有所不同 (图4)。进一步对其中7株肠道细菌16S rDNA V3区基因序列进行比对 (图5)，结果显示，Zf1、Zf11序列完全相同，表明为同一种菌；Zf4、Zf8序列基本相同，为同一种菌。Zf5、Zf7、Zf10序列互不相同，且与Zf1、Zf11以及Zf4、Zf8均有较大差别，初步鉴定为不同菌种，此结果与16S rDNA-SSCP图谱一致。

图4 16S rDNA V3区基因的PCR-SSCP图谱Fig.4 PCR-SSCP results of the V3 region gene of l6S rDNA of the bacteria from the intestine of zebrafish

图5 16S rDNA基因V3区基因序列比对Fig.5 Homological analysis of 16S rDNA V3 region sequences

3 讨论

3.1 鱼类肠道细菌的多样性研究

近年来，对动物肠道微生物的研究主要集中于哺乳类动物[12-14]，而对模式生物斑马鱼肠道菌群进行分离鉴定的研究则鲜有文献报道[1，3]。国内对鱼类肠道菌群组成的研究起步相对较晚。迄今，相关学者对大弹涂鱼[15]、青石斑鱼[16]肠道菌群进行鉴定分析，并发现了肠道优势菌群与细菌种属，认为这些优势菌群可能是参与消化生理活动的主要菌群。樊海平等[17]研究发现，日本鳗鲡肠道中细菌数量与栖息水体、生理状态、饵料状况等有关。赵庆新[18]以草鱼、鲤等鲤科Cyprinidate鱼类为研究对象，分析了其肠道细菌的菌群结构，结果表明，鱼类肠道中主要有致病杆菌属Xenorhabdus、气单胞菌属Aeromonas、柠檬酸杆菌属Citrobacter、假单胞杆菌属Pseudomonas等。本研究中，采用PCRSSCP的分子技术鉴定方法研究了斑马鱼肠道细菌多样性，16S rDNA系统发育树分析显示，以Zf1、Zf11为代表的菌株与已知种细菌Aeromonas veronii，Zf5与 Bacillus subtilis， Zf4、 Zf8与 Sphingomonas sp.，Zf7与Aeromonas sp.分别聚为一支，且16S rDNA序列一致性高达99%；同时从斑马鱼肠道中分离获得Zf10菌株与uncultured bacterium clone一致性为92%，表明有可能为一种新分离菌株。斑马鱼肠道细菌16S rDNA分子鉴定表明，Zf1、Zf7和Zf11属于气单胞菌属Aeromonas，Zf4、Zf8属于鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas，Zf5属于芽孢杆菌属Bacillus。此外，斑马鱼肠道细菌Zf2、Zf3、Zf6、Zf9和Zf12等分离株构建的阳性克隆，测序尚未成功，这可能与鱼类肠道细菌多样性、菌株生物学特性和试验技术条件因素有关。已有研究报道，利用宏基因组技术可进行微生物多样性结构和功能基因组研究[7]。本试验中通过对斑马鱼肠道细菌16S rDNA的基因克隆测序分析，发现Zf10与尚未获得纯培养的菌株uncultured bacterium GI3-M-5-G01聚为一支，一致性为92%，推测菌株Zf10可能是一种新分离菌种，有待进一步研究鉴定，以丰富斑马鱼肠道微生物物种资源。

3.2 鱼类肠道细菌PCR-SSCP分析

有研究表明，16S rDNA序列分析在细菌鉴定方面具有不可替代的作用，结合SSCP技术可以提高检测的特异性[9-10]。细菌16S rDNA既有保守区，也有相对变异区，因此，可以采用PCR-SSCP技术进行鉴定分析[8]。王永等[9]对于4种食源性致病菌16S rDNA的可变区进行SSCP分析，结果表明，4种致病菌16S rDNA单链构象多态性具有种属特异性。本试验结果表明，斑马鱼肠道分离菌种的SSCP图谱无论从条带的数目、相对迁移率及条带之间的间距看，相互间均存在明显差异，其中Zf1与Zf11带型一致，Zf4与 Zf8带型一致，而Zf5、Zf7、Zf10带型各不相同，与前两种带型也有所不同。通过构建16S rDNA系统进化树分析发现，其SSCP图谱差异似与亲缘关系成正比，即亲缘关系越远，差异越明显。此外，16S rDNA基因V3区片段大小约为200 bp，利用SSCP分析V3区基因片段分辨率较高，得到的图谱也较清晰；尽管如此，利用SSCP技术进行分析时也有其缺陷，比如，当分离片段较大 (＞400 bp)时，会出现分辨率低、共迁移等现象[9，19]。此外，有学者利用PCR-DGGE、PCR-RFLP技术进行肠道微生物、病原菌分析鉴定研究[19-20]。本研究中，斑马鱼肠道细菌16S rDNA基因V3区的PCR-SSCP结果与16S rDNA基因序列比对结果一致，值得进一步研究。

综上所述，本研究中从斑马鱼肠道分离纯化出的12株细菌，其中气单胞菌属Aeromonas等优势菌株与其他学者研究报道结果一致[15，18]，这为今后进行斑马鱼肠道菌群及其微生态功能研究提供了科学依据，也为PCR-SSCP技术应用于斑马鱼肠道细菌多样性分析提供了参考。

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