金钱草总黄酮对草酸钙结晶肾损伤的作用机制

解海杰，高宏伟，王 军，李传波，张昌文，刘春雨

全世界泌尿系结石的发病率已达10%～15%[1]。一水合草酸钙（calcium oxalate monohydrate，COM）可刺激肾小管上皮细胞并引起肾损伤[2]，促进草酸钙结晶粘附，进一步引起结晶积聚和结石形成[3]。复方金钱草颗粒具有抗肾结石、利尿、减轻输尿管张力和抗炎作用,对尿路结石有良好的防治作用[4]。最近的研究显示，金钱草黄酮提取物能抑制高草酸尿症大鼠肾脏草酸钙晶体的形成[5-6]。但金钱草总黄酮抑制草酸钙结石的机制并不明确，本文探讨金钱草总黄酮提取物对COM诱导肾小管上皮细胞凋亡所致肾损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂及药物 金钱草总黄酮购自于西安天瑞生物技术有限公司。第一抗体抗人肾损伤分子（kidney injury molecule-1，KIM-1）、抗LC3-II、抗p-p38、抗p38（1:1000）、内参β-actin均购自于Merck Millipore。

1.2 COM晶体准备 二水氯化钙（10 mmol/L,CaCl2·2H2O）和草酸钠（10 mmol/L, Na2C2O4）购自国药，加入到缓冲液Tris-HCl（10 mmol/L,pH 7.4）中，使其终浓度分别为5 mmol/L和0.5 mmol/L。混合液于室温下过夜，然后在3000 r/min转速下离心5 min。弃上清，用甲醇清洗沉淀。3000 r/min离心5 min后去甲醇，沉淀干燥后于37℃过夜。在紫外线辐射下净化30 min，即制备成COM晶体。

1.3 细胞培养与处理 肾小管上皮细胞（HK-2细胞）购自于中国科学院上海细胞库，于含有10%胎牛血清（Gibco）、1.2%青霉素/链霉素、2mol/L的L-谷氨酸的DMEM培养基中培养，并置于含5%CO2培养箱中于37 ℃孵育。HK-2细胞接种于24孔板过夜。COM晶体处理细胞48 h使其终浓度分别为0.1、0.5、1、2和5 mmol/L。

1.4 仪器 Eppendorf 5418 小型高速离心机（德国），BINDER C150二氧化碳培养箱（德国），赛默飞Multiskan GO全波长读数仪（美国），BD FACS 420流式细胞仪（美国），GE Typhoon FLA 9500 多功能激光成像仪（美国）。

1.5 分组 将肾小管上皮细胞分为6组：对照组、金钱草总黄酮处理组（TF组）、p38丝裂原活化激酶（p38/MAPK）抑制组（SB组）、COM处理组（COM组）、COM和金钱草总黄酮处理组（CTF组）、COM和p38/MAPK抑制组（CSB组）。TF组给予50 μg/mL金钱草总黄酮处理，SB组给予50 μmol/L的SB203580即p38/MAPK抑制剂处理，COM组给予2 mmol/L的COM处理，CTF组给予COM和50 μg/mL金钱草总黄酮处理，CSB组给予2 mmol/L的COM和50 μmol/L的SB203580处理。

1.6 观察指标及检测方法 （1）测定细胞存活率。WST-1法检测HK-2细胞的生存能力，测定细胞存活率。不同处理组的HK-2细胞（对照组，0.1、0.5、1、2和5 mmol/L COM组）接种于含DMEM（10%胎牛血清）的96孔板中，随后将WST-1加入培养孔中于37 ℃孵育2 h。分光光度计设定测量波长450 nm，参考波长630 nm，读取各组吸光度值A。各组细胞活力以其吸光度值与空白对照组吸光度值的比值表示。（2）测定细胞凋亡率，用流式细胞术检测细胞凋亡数。收集6组细胞，1500 r/min离心5 min，PBS液洗涤3次。加入1×Annexin V结合缓冲液使各组细胞终浓度为5×105/mL。加入Annexin-V和PI溶液（1 μg/mL，100 μg）于室温染色15 min。用流式细胞术检测细胞凋亡数。细胞凋亡率（%）=（凋亡细胞数/总细胞数）×100%。（3）蛋白免疫印迹测定肾损伤标志物KIM-1，肾小管细胞损伤通路相关分子p38及自噬相关蛋白LC3-II的表达。RIPA缓冲液提取来自于不同组别的HK-2细胞中的总蛋白。蛋白溶液于12 000 r/min离心15 min，BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。10% SDS-PAGE凝胶分离蛋白，转膜。5%脱脂奶粉封闭2 h。ECL系统（GE）检测蛋白质-抗体复合物。

1.7 统计学处理 统计分析采用SPSS17.0统计软件。各组间的比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用bonferroni方法，以P ＜ 0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 COM诱导降低HK-2细胞存活率 应用COM处理HK-2细胞建立体外泌尿系结石细胞模型，与对照组相比，随着COM浓度的增加，HK-2细胞的存活率逐渐下降（图1）。

图1 不同浓度COM处理HK-2细胞后的细胞存活率

图2 2 mmol/L COM诱导HK-2细胞不同时长KIM-1、LC3-II、p-p38和p38蛋白含量的变化

2.2 COM诱导HK-2细胞不同时长KIM-1，LC3-II，p-p38和p38蛋白含量的变化 应用COM处理肾小管上皮细胞建立体外泌尿系结石细胞模型，在2 mmol/L COM处理的肾小管上皮细胞中，随着时间的增加， KIM-1、p-p38、LC3-II表达增加（图2）。

2.3 阻断p38/MAPK通路对COM诱导的HK-2细胞凋亡的影响 COM可诱导HK-2细胞凋亡增加，CSB组细胞凋亡率较COM组细胞凋亡率降低，应用p38/MAPK抑制剂SB203580可抑制COM诱导的细胞凋亡（图3、4）。

图3 各组HK-2细胞凋亡率的变化

图4 阻断p38/MAPK通路对COM诱导的HK-2细胞凋亡的影响

2.4 阻断p38/MAPK通路对COM诱导的HK-2细胞自噬的影响 COM可诱导HK-2细胞过度自噬，CSB组自噬相关蛋白LC3-II较COM组细胞降低（图5、6）。

图5 各组LC3-II/actin表达水平

图6 阻断p38/MAPK通路对COM诱导HK-2细胞LC3-II/actin表达水平的变化

2.5 金钱草总黄酮对COM诱导HK-2细胞p-P38蛋白表达的影响 Western blotting结果显示，CTF组较COM组p-p38蛋白水平降低，说明金钱草总黄酮可阻断p38/MAPK通路（图7）。2.6 金钱草总黄酮对COM诱导的HK-2细胞存活率的影响 随着金钱草总黄酮浓度的增加，HK-2细胞存活率也逐渐增加，说明金钱草总黄酮对HK-2细胞具有保护作用（图8）。

图7 金钱草总黄酮对COM诱导HK-2细胞p-P38蛋白表达的影响

图8 不同浓度金钱草总黄酮对COM诱导的HK-2细胞存活率的影响

2.7 金钱草总黄酮对COM诱导的HK-2细胞凋亡的影响 CTF组细胞凋亡率较COM组细胞凋亡率降低，金钱草总黄酮可抑制COM诱导的细胞凋亡（图3、9）。

图9 金钱草总黄酮对COM诱导的HK-2细胞凋亡的影响

2.8 金钱草总黄酮对COM诱导的HK-2细胞自噬的影响 CTF组自噬相关蛋白LC3-II较COM组降低，金钱草总黄酮可抑制COM诱导的细胞过度自噬（图5、10）。

图10 金钱草总黄酮对COM诱导的HK-2细胞自噬LC3-II水平的变化

3 讨论

泌尿系结石是全球性常见病，其发病率约10%～15%，并有逐年增高的趋势[7]。虽然如体外冲击波碎石术、经皮肾镜取石术、经尿道输尿管镜取石术等微创技术已广泛应用并取得成效，但泌尿系结石的复发率仍然很高[8]。泌尿系结石成分最常见的是草酸钙结石，其中COM约占80%。目前结石成因最为重要的观点是草酸钙对肾小管上皮细胞损伤假说[9]。本研究发现随着COM浓度的升高，细胞存活率逐渐降低，并且KIM-1、p38及自噬相关蛋白LC3-II的表达也增加，抑制p38/MAPK通路可减少细胞过度自噬和凋亡。肾损伤标志物KIM-1是MAPK的下游基因，推测草酸钙通过激活p38/MAPK通路引起肾小管上皮细胞出现过度自噬，细胞凋亡水平增加，导致肾小管上皮细胞的损伤。这与Paleerath等[10]研究结果相一致，其研究发现COM晶体会通过p38 MAPK活化导致肾小管上皮细胞紧密连接屏障功能的破坏。草酸钙导致的肾损伤与p38/MAPK通路激活有关，从而导致草酸钙晶体的沉积，而抑制p38/MAPK通路可减少肾小管上皮细胞凋亡[11]。

金钱草作为排石之要药，其临床作用已得到不断地验证，但其作用机制尚不明确。研究显示金钱草可抑制草酸钙结晶聚集并减轻肾损伤[12]。Rodgers等[13]报道，金钱草汤剂可显著降低人工合成尿液中草酸钙结晶的平均体积，并减少草酸钙结晶的饱和率，从而证明金钱草可能是一种有效的草酸钙抑制剂。Zhao等[14]发现黄酮类是金钱草正丁醇部位的主要成分，总黄酮对OH-和O2-具有清除功能，且能减少乙二醇诱导的大鼠肾结石的形成。最近研究[15]在动物实验发现金钱草总黄酮具有抗氧化应激作、抗炎作及碱化尿液的作用，降低单核细胞趋化蛋白-1、骨桥蛋白的水平，减轻肾损伤，抑制结石的形成。本研究发现在COM处理过的HK-2细胞中加入金钱草总黄酮后KIM-1、p38及自噬相关蛋白LC3-II的表达水平降低，同时细胞凋亡水平降低，推测金钱草总黄酮可阻断p38/MAPK通路，抑制COM诱导的HK-2细胞凋亡和过度自噬，起到保护肾小管上皮细胞的作用。

综上所述，草酸钙可能通过激活p38/MAPK通路导致肾小管上皮损伤，使草酸钙晶体发生黏附，从而形成结石。而金钱草总黄酮可通过阻断p38/MAPK通路抑制肾小管上皮细胞的过度自噬和凋亡，减少肾小管上皮细胞的损伤，从而抑制泌尿系结石的形成。

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