温敏性碳量子点的快速制备、荧光性质及细胞成像应用

张现峰，芦静波，王学梅

(1.蚌埠学院 材料与化学工程学院，安徽 蚌埠 233030；2.安徽省多糖药物工程技术研究中心，皖南医学院 药学院， 安徽 芜湖 241000)

精确测量温度变化对深刻理解纳米体系的反应机理与细胞中的生化及生理行为均有重要意义[1-2]。目前，纳米/微米空间的温度测量方法主要有热电偶、热阻抗和红外线等[3-5]，原位和非接触温度测量仍是难题。荧光碳量子点(CQDs)是一类近似球形，尺寸小于10 nm的纳米粒子，由少量分子或原子组成[6-7]。自被发现以来，碳量子点在分析检测、生物传感、光催化以及光电子器件等领域引起了广泛关注[8-10]。与传统的半导体量子点和有机染料相比，碳量子点具有毒性低、生物相容性良好、光学性质稳定、化学性质稳定，以及表面易功能化等优点[11-12]。有文献报道碳量子点的荧光强度随着温度的增加而减小[13]。然而，由于这些碳量子点的荧光强度与温度弱的线性关系，限制了其在原位温度传感器方面的应用。最近，Guo课题组[14]通过煅烧山竹果肉制备了荧光碳量子点，随着该碳量子点温度从10 ℃增加到90 ℃，其荧光强度减小约50%，荧光强度与温度线性关系良好(r2=0.984 2)，可以作为荧光温度探针。

另外，荧光量子产率(QY)是评判荧光材料的重要性质，量子产率的高低直接影响材料的实际应用。然而，目前很多方法制备的碳量子点荧光量子产率偏低，大大限制了其作为荧光纳米探针在细胞成像等方面的应用。为了增强碳量子点的性能和开发其它潜在应用，很多学者期望采用简便、有效的方法合成高荧光量子产率的碳量子点[15-16]。目前，提高碳量子点的荧光量子产率，主要通过化学还原、表面钝化和修饰等方法[17-19]。然而，这些方法需较长的反应时间，或需要有毒试剂，且需要复杂的后处理过程。因此，寻找通用、简便的方法合成高荧光量子产率的碳量子点越来越受到人们的重视。相比而言，通过氮掺杂方法合成碳量子点是提高碳量子点荧光量子产率的一种有效而简便的方法[20-21]，但目前文献报道并不多。

目前以草酸和尿素为混合碳源，超纯水为溶剂，通过微波加热一步合成氮掺杂的碳量子点尚未见报道。本研究发现，相比于单独使用草酸为碳源，利用尿素进行氮掺杂可以得到较高荧光量子产率的碳量子点。另外，随着温度的增加，碳量子点的荧光强度减小，当温度反向降低时，其荧光强度能够恢复到原始值。在10～80 ℃温度范围内，相对荧光强度与温度之间存在良好的线性关系。本文通过对所合成的碳量子点的表征、细胞毒性以及细胞成像实验，证明合成的碳量子点水溶性好、抗盐性能优异、稳定性强、细胞毒性小，有望作为温敏性的光学纳米探针在细胞研究方面得到应用。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

小鼠结肠癌细胞(CT26.WT)购于上海生化与细胞研究所，草酸购于天津市润金特化学品有限公司，尿素和DMSO购于上海阿拉丁化学试剂有限公司，RPMI-1640培养基和FBS购于上海Gibco生命技术公司，双抗(青霉素/链霉素，浓度104U/mL)购于碧云天生物试剂有限公司。实验用水为超纯水，所用试剂均为分析纯。

家用格兰仕微波炉(广东格兰仕微波炉电器公司，G70F20CN3L-C2)，F97PR0荧光分光光度计(上海棱光技术有限公司)，TU-1901型紫外-可见光谱仪(北京普析通用仪器有限责任公司)，FTIR-850型傅立叶变换红外光谱仪(天津港东科技发展股份有限公司)，JEM-2100型透射电子显微镜(日本电子株式会社)，PHS-3C型pH计(上海雷磁仪器仪表有限公司)，Labconco冷冻干燥系统(美国Labconco公司)，Bio Rad 550型酶标仪(美国伯乐公司)，Leica SP8激光扫描共聚焦显微镜(德国徕卡微系统股份公司)。

1.2 荧光碳量子点的制备

用电子天平准确称取1.8 g草酸和0.6 g尿素置于洁净的100 mL锥形瓶中，加入25 mL超纯水，磁力搅拌15 min至草酸与尿素完全溶解，然后放入微波炉(560 W)中加热10 min。取出锥形瓶，冷却，加入20 mL超纯水，超声5 min，再用滤膜(0.22 μm)过滤，除去滤渣，所得滤液即为碳量子点的水溶液。经过冷冻干燥后，称重，溶于超纯水中用于细胞毒性和细胞成像测试。

1.3 荧光碳量子点的性能与结构表征

在5 mL离心管中，加入150 μL碳量子点储备液(10 mg/mL)，加水稀释至3 mL，混合均匀，340 nm激发光下测试碳量子点的荧光光谱(波长范围360～600 nm)。取20 μL碳量子点水溶液滴在铜网上，静置空气中干燥，用透射电子显微镜(TEM)在200 kV加速电压下测试碳量子点的形貌和粒径。碳量子点的红外光谱(FTIR)表征采用KBr压片法(扫描范围4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数32次)。

1.4 荧光量子产率测定

首先将硫酸奎宁溶于0.1 mol/L硫酸溶液中(量子产率为54%)，分别测量碳量子点和硫酸奎宁的积分荧光强度(360 nm激发)和吸光度(360 nm处)，然后按照下式计算碳量子点的荧光量子产率：

式中，st 和x分别代表硫酸奎宁标准溶液和碳量子点溶液，φ和I分别为荧光量子产率和积分荧光强度，A和η分别为吸光度和折光率(均为1.33)，为了减小再吸收效应，保持测试溶液360 nm处的吸光度小于0.05。

1.5 细胞毒性测试

收集CT26.WT细胞，调整细胞浓度，接种于96孔板中，置于CO2培养箱中培养12 h，分别加入不同浓度的碳量子点溶液(0～1 000 μg/mL)培养24 h。实验设置空白对照组，每组设6个平行复孔，待培养结束前4 h，加入10 μL的MTT溶液终止培养，CO2培养箱内继续孵育4 h，加入DMSO溶解蓝紫色结晶。测定各孔在490 nm处的光密度(OD)值。实验至少重复3次。不同浓度碳量子点存在下的细胞存活率根据以下公式计算：细胞存活率(%)=OD实验组/OD对照组×100%。

1.6 细胞成像实验

培养皿中培养CT26.WT细胞，调整细胞浓度，置于1 mL的碳量子点溶液(1 mg/mL)中处理细胞24 h，结束后去培养基，PBS洗涤细胞3次，激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍照。

2 结果与讨论

2.1 草酸及尿素质量比对碳量子点荧光量子产率的影响

表1 不同质量比的草酸和尿素制备的碳量子点的荧光量子产率Table 1 Quantum yields(QYs) of CQDs synthesized by different mass ratios of oxalic acid and urea

为了合成量子产率较高的碳量子点，首先研究了不同质量比的草酸和尿素对合成的碳量子点荧光量子产率的影响。从表1可以看出，尿素可以有效提高碳量子点的荧光量子产率。随着尿素比例的增加，氮含量增加，碳量子点的量子产率逐渐提高，这是由于得到的碳量子点中掺杂的氮主要是石墨型氮，有利于荧光量子产率[21-23]提高。当草酸和尿素质量比为3∶1时，得到的碳量子点荧光量子产率最高，为9.5%。继续增加尿素比例，荧光量子产率反而下降，这可能是因为氮含量的增加，改变了碳量子点的结构，进而改变了其光学性质[20]。

2.2 碳量子点的表征

图1 碳量子点的紫外-可见吸收光谱(A)及激发和发射光谱(B)Fig.1 UV-Vis absorption spectrum(A) and excitation and emission spectra(B)of the synthesized CQDs inset:photographs of CQDs solution taken under visible light and 365 nm UV light

图2 碳量子点在不同激发波长(310～390 nm)下的荧光发射光谱Fig.2 Fluorescence spectra of the synthesized CQDs at different excitation wavelengths from 310 nm to 390 nm

图3A为合成碳量子点的透射电镜图片，由图中可以看出，该方法合成的碳量子点近似球形，单分散性良好，无团聚现象，高斯拟合曲线显示碳量子点的平均粒径约3.8 nm(图3B)。

图3 合成碳量子点的TEM图片(A)和粒径分布(B)

图4 碳量子点的红外光谱图Fig.4 FTIR spectrum of CQDs

2.3 碳量子点的荧光性质

制备的碳量子点在10～80 ℃的温度范围内，具有良好的温度敏感的荧光性质(图5A)。随着温度从10 ℃增加到80 ℃，碳量子点在410 nm处的荧光强度约减小25%，当温度降低时，其荧光强度又恢复到原始值(图5B)。以10 ℃时的荧光强度为参比，相对荧光强度与温度之间存在良好的线性关系，加热和冷却过程中，线性拟合的相关系数(r2)分别为0.980和0.990。碳量子点的荧光强度对温度的线性响应，可能是碳量子点表面大量的含氧基团和氢键的协同作用所引起[27]，这说明此量子点在温度相关的荧光传感领域有潜在的应用价值。

图5 碳量子点在不同温度下的荧光光谱(A)和碳量子点的相对荧光强度(以10 ℃时的荧光强度为参比)与温度之间的关系(B)Fig.5 Fluorescence spectra of the as-prepared CQDs at various temperatures(A) and the relative fluorescence intensity(I/I0) of CQDs as a function of temperature during heating and cooling processes(the fluorescence intensity at 10 ℃ as the reference)(B)

研究了不同离子强度(通过不同NaCl浓度调控)对荧光碳量子点的影响。碳量子点溶液中含有不同浓度NaCl(0～1.0 mol/L)时，碳量子点的荧光强度和峰特征无明显的变化，说明合成的碳量子点具有良好的抗盐能力。

2.4 碳量子点的细胞成像分析

用MTT实验研究了碳量子点的细胞毒性。实验结果显示，当碳量子点质量浓度小于600 μg/mL 时，CT26.WT细胞存活率大于92%，碳量子点质量浓度为1 000 μg/mL 时，CT26.WT细胞存活率为85%。由于独特的荧光性质、良好的水溶性以及低毒性，制备的碳量子点可以用于细胞标记和成像。图6为碳量子点标记的CT26.WT细胞在405 nm激发光下的激光共聚焦成像图。从图6可以看出，细胞在激发光下发出明亮的蓝光，说明碳量子点已成功标记了CT26.WT细胞，其主要通过细胞内吞作用分布在细胞膜和细胞质中。同时，未观察到任何细胞损伤，说明细胞毒性较小。以上结果显示制备的碳量子点有望作为光学探针在细胞成像方面得到应用。

3 结 论

以草酸和尿素为混合碳源，采用微波法一步快速合成了具有蓝色荧光的氮掺杂的碳量子点，所需原料简单易得，实验操作简便。对碳量子点进行氮掺杂能有效提高其荧光量子产率，当草酸和尿素质量比为3∶1时，荧光量子产率最高，为9.5%，远高于不掺氮的碳量子点。制备的氮掺杂的碳量子点近似球形，具有良好的水溶性、抗盐性能和稳定性。同时，碳量子点的相对荧光强度和温度之间存在良好的线性响应关系，说明此量子点在温度相关的荧光传感领域有潜在的应用价值。MTT细胞存活率实验和共聚焦荧光成像测试表明制备的碳量子点细胞毒性小，生物相容性好，有望作为荧光纳米探针应用于细胞成像等领域。

图6 CT26.WT细胞和碳量子点(1 mg/mL)培育24 h后的共聚焦荧光图像Fig.6 Confocal fluorescence images of CT26.WT cells incubated with CQDs(1 mg/mL) for 24 h A.bright field ,B.excitation wavelength of 405 nm,C.merged images of the A and B images

[1] Kucsko G,Maurer P C,Yao N Y,Kubo M,Noh H J,Lo P K,Park H,Lukin M D.Nature,2013,500(7460):54-58.

[2] Wang Z P,Ananias D,Carné-Sánchez A,Brites C D S,Imaz I,Maspoch D,Rocha J,Carlos L D.Adv.Funct.Mater.,2015,25(19):2824-2830.

[3] Liu H X,Sun W Q,Xu S Y.Adv.Mater.,2012,24(24):3275-3279.

[4] Di Gioacchino D,Marcelli A,Puri A,De Sio A,Guidi M C,Kamili Y,Della Ventura G,Notargiacomo A,Postorino P,Mangialardo S,Woerner E,Pace E.ACSAppl.Mater.Interfaces,2015,7(20):10896-10904.

[5] Jin Y,Ikawa S I.J.Chem.Phys.,2003,119(23):12432-12438.

[6] Baker S,Baker G.Angew.Chem.Int.Ed.,2010,49(38):6726-6744.

[7] Li H T,Kang Z H,Liu Y,Lee S T.J.Mater.Chem.,2012,22(46):24230-24253.

[8] Huang Q T,Lin X F,Li F M,Weng W,Lin L P,Hu S R.Prog.Chem.(黄启同,林小凤,李飞明,翁文,林丽萍,胡世荣.化学进展),2015,27(11):1604-1614.

[9] Choi H,Ko S,Choi Y,Joo P,Kim T,Lee B R,Jung J,Choi H J,Cha M,Jeong J,Hwang I,Song M H,Kim B,Kim J Y.Nat.Photonics,2013,7(9):732-738.

[10] Li X Q,Yuan F,Cao G X,Wang G L.J.Instrum.Anal.(李小琴，袁芳，曹根霞，王光丽.分析测试学报),2017,36(6):794-799.

[11] Park S Y,Lee H U,Park E S,Lee S C,Lee J W,Jeong S W,Kim C H,Lee Y C,Huh Y S,Lee J.ACSAppl.Mater.Interfaces,2014,6(5):3365-3370.

[12] Chen H,Xie Y,Kirillov A M,Liu L,Yu M,Liu W,Tang Y.Chem.Commun.,2015,51(24):5036-5039.

[13] Wang C X,Xu Z Z,Cheng H,Lin H H,Humphrey M G,Zhang C.Carbon,2015,82:87-95.

[14] Yang R,Guo X F,Jia L H,Zhang Y,Zhao Z L,Lonshakov F.Appl.SurfaceSci.,2017,423(30):426-432.

[15] Dong Y,Pang H,Yang H B,Guo C,Shao J,Chi Y,Li C M,Yu T.Angew.Chem.Int.Ed.,2013,52(30):7800-7804.

[16] Sun H,Wu L,Gao N,Ren J,Qu X.ACSAppl.Mater.Interfaces,2013,5(3):1174-1179.

[17] Zheng H,Wang Q,Long Y,Zhang H,Huang X,Zhu R.Chem.Commun.,2011,47(38):10650-10652.

[18] Zhu S,Zhang J,Tang S,Qiao C,Wang L,Wang H,Liu X,Li B,Li Y,Yu W,Wang X,Sun H,Yang B.Adv.Funct.Mater.,2012,22(22):4732-4740.

[19] Sun Y P,Zhou B,Lin Y,Wang W,Fernando K A,Pathak P,Meziani M J,Harruff B A,Wang X,Wang H F,Luo P G,Yang H,Kose M E,Chen B,Veca L M,Xie S Y.J.Am.Chem.Soc.,2006,128(24):7756-7757.

[20] Zhang Y Q,Ma D K,Zhuang Y,Zhang X,Chen W,Hong L L,Yan Q X,Yu K,Huang S M.J.Mater.Chem.,2012,22(33):16714-16718.

[21] Zhang Y Q,Liu X Y,Fan Y,Guo X Y,Zhou L,Lv Y,Lin J.Nanoscale,2016,8(33):15281-15287.

[22] Zhu S,Meng Q,Wang L,Zhang J,Song Y,Jin H,Zhang K,Sun H,Wang H,Yang B.Angew.Chem.Int.Ed.,2013,52(14):3953-3957.

[23] Zhou J,Yang Y,Zhang C Y.Chem.Commun.,2013,49(77):8605-8607.

[24] Hsu P C,Chang H T.Chem.Commun.,2012,48(33):3984-3986.

[25] Liu Y,Xiao N,Gong N,Wang H,Shi X,Gu W,Ye L.Carbon,2014,68(3):258-264.

[26] Zhou L,Li Z H,Liu Z,Ren J S,Qu X G.Langmuir,2013,29(21):6396-6403.

[27] Yang Y M,Kong W Q,Li H,Liu J,Yang M M,Huang H,Liu Y,Wang Z Y,Wang Z Q,Sham T K,Zhong J,Wang C,Liu Z,Lee S T,Kang Z H.ACSAppl.Mater.Interfaces,2015,7(49):27324-27330.