应用可视芯片技术高通量鉴别8种鱼成分

韩建勋，陈 颖*，王 斌，张九凯，马秀丽

(1.中国检验检疫科学研究院 农产品安全研究中心，北京 100176；2.中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京 100083)

受经济利益的驱动，全球鱼肉市场以次充好、掺假问题层出不穷。有报道称，德国产鲽科鱼的抽检标识不符比例达25%；在美国波士顿和洛杉矶，鱼肉虚假标识的比例分别高达48%和55%[1]。我国媒体也曾曝光国内超市将油鱼冒充鳕鱼的事件。鱼肉掺假问题不仅影响国际间进出口贸易秩序，而且会降低社会诚信度，损害消费者利益。

对于未加工鱼类，消费者很容易靠外观、形态、花纹及颜色进行区分，但经绞碎、研磨、烘烤、油炸等加工处理的无骨鱼、鱼糜、鱼肉罐头或生鲜调理食品等，则很难利用形态学鉴别。近年来科技人员采用光谱[2-4]、质谱[5-6]、生物传感[7]、PCR(Polymerase chain reaction)[8-9]、DNA条码[10-13]等现代分析技术在鱼肉真伪鉴别方面开展了广泛研究，取得了不错的成果。有研究采用近红外光谱技术，结合主成分分析和BP人工神经网络技术建立了青、草、鲢、鳙、鲤、鲫、鲂7 种淡水鱼的品种鉴别模型，准确率达96.4%[4]。该技术前处理简单、检测速度快，但鱼类的光谱曲线易受不同养殖环境、不同产地等因素的影响，因此数据库模型的构建需大量代表性样本。也有文献通过构建电化学生物传感体系，检测大西洋鲑与虹鳟特异PCR扩增产物产生的差异循环伏安信号，从而鉴别鱼肉样品来源[7]，但实验检测电极易吸附非特异DNA，进而影响结果的特异性。随着分子生物学技术的发展，以PCR为基础的DNA分析技术已成为物种鉴定的主流。有文献提出以COI(Cytochrome C oxidase I)基因为靶基因，通过建立大西洋鲑的SYBR-Green 熔解曲线方法，可准确鉴别大西洋鲑、红鲑、银鲑与大马哈鱼及其制品[14]，方法简便、成本低，但一次扩增只能检测1个物种，通量较低。也有报道利用大西洋鲑线粒体CR(Control region)区段设计特异性LAMP 引物，建立了大西洋鲑种类鉴定的LAMP 检测方法[15]。LAMP方法简便快速，但特异性引物设计难度较大。近几年，DNA 条形码技术在物种鉴别领域发展迅速。有研究以鱼COI基因为目标基因，应用DNA条形码技术调查深圳批发市场和超市零售鱼肉制品的种类来源，发现77份鱼肉制品中有28份样品的标签标示不符，错标率达36.36%[13]。DNA 条形码技术鉴别物种虽然准确率和通量高，但必须依赖DNA 测序技术，步骤多，成本高。可视芯片技术作为一种利用特异探针杂交产生可见信号的基因芯片技术，具有操作简单、通量高和结果肉眼可见的特点，已在病原微生物[16]、食源性过敏原[17]以及转基因作物[18]检测中得到应用。

本文针对市场中常见的多宝鱼、银鲳鱼、金枪鱼、暗纹东方鲀、青石斑鱼、带鱼、大黄鱼以及东星斑鱼8种鱼类，采用可视芯片技术建立了一种鱼肉及其制品中8种鱼源性成分的高通量快速检测方法，旨在为鱼肉制品的溯源和安全监管提供新的技术支撑。

1 实验部分

1.1 材 料

1.1.1样品大黄鱼(Larimichthyscrocea)由辽宁出入境检验检疫局检验检疫技术中心提供，青石斑鱼(Epinephelusawoara)与东星斑鱼(Plectropomusleopardus)由厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心提供，暗纹东方鲀(Takifuguobscurus)由福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心提供，金枪鱼(Thunnusthynnus)由上海出入境检验检疫局检验检疫技术中心提供，多宝鱼(Psettamaxima)、带鱼(Benthodesmuselongatus)以及银鲳鱼(Pampusargenteus)购自北京超市。所有鱼肉样品均在-20 ℃保存备用。

1.1.2引物与探针所有引物与探针均根据多宝鱼、银鲳鱼、金枪鱼、暗纹东方鲀、青石斑鱼、带鱼、大黄鱼以及东星斑鱼的小清蛋白基因序列比对结果设计。为避免杂交反应出现假阴性，且作为探针阵列的定位点，实验中需要合成一段由20个腺嘌呤组成的阳性对照(5′-ALD-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3′-Biotin)。其中，鱼肉通用-反向引物5′端进行生物素(Biotin)标记，在探针和阳性对照的5′端进行醛基(ALD)修饰，以使探针和阳性对照能与芯片表面修饰的氨基结合固定。

表1 引物及探针序列Table 1 The sequence of primers and probes

1.1.3试剂与仪器EX Taq DNA polymerase、dNTPs、10×PCR 缓冲液购自宝生物工程(大连)有限公司；CTAB裂解液(20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris、20 mmol/L Na2-EDTA，pH 8.0)、CTAB沉淀液(5 g/L CTAB，0.04 mol/L NaCl，pH 8.0)、1.2 mol/L NaCl等为自行配制；蛋白酶K、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇等购自北京宏捷有限公司。

微量移液器(10、20、100、1 000 μL，德国Eppendorf公司)，精密烘箱(Venticell，德国 MMM公司)，恒温均匀器(Thermomixer Comfort，德国Eppendorf公司)，电子天平(BS，德国Sartorius公司)，离心机(5804R，德国Eppendorf公司)，PCR扩增仪(Mastercycler gradient，德国Eppendorf公司)，生物芯片点样系统(AD3200，美国BioDot公司)。

1.2 实验方法

1.2.1样品DNA提取取研磨过的鱼肉原料或市售样品0.1 g至2.0 mL离心管中，后续DNA提取参照文献中的CTAB法[17]。

1.2.2常规PCR扩增反应体系为25 μL：DNA模板5 μL；10×PCR反应缓冲液2.5 μL；dNTPs 2.0 μL；正/反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL；EX Taq DNA polymerase 0.3 μL，用无菌水补至总体积为25 μL。

扩增参数为：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸5 min。

图1 鱼类探针的可视芯片点样图Fig.1 Schematic diagram of capture probes for fish species on the chip1.Turbot(多宝鱼)；2.Silvery pomfret(银鲳鱼)；3.Tuna(金枪鱼)；4.Obscura puffer(暗纹东方鲀)；5.Indigo hamlet(青石斑鱼)；6.Hairtail(带鱼)；7.Large yellow croaker(大黄鱼)；8.Miniatus grouper(东星斑鱼)；P.Positive control(阳性对照)(biotin-dA20)

1.2.3可视芯片的制备与杂交芯片的制备与杂交程序参照文献[16]的方法。利用生物芯片点样仪将多宝鱼、银鲳鱼、金枪鱼、暗纹东方鲀、青石斑鱼、带鱼、大黄鱼、东星斑鱼以及阳性对照等探针以十字形图案方式进行点样(图1)。

1.2.4可视芯片特异性分析单组分鱼肉特异性分析：为验证鱼类探针的特异性，采用鱼肉通用引物对分别扩增多宝鱼、银鲳鱼、金枪鱼、暗纹东方鲀、青石斑鱼、带鱼、大黄鱼、东星斑鱼等DNA，扩增条件同“1.2.2”所述，将PCR产物分别与芯片进行杂交反应，用无菌水作空白对照。

多组分鱼肉特异性分析：将多宝鱼、银鲳鱼、金枪鱼、暗纹东方鲀、青石斑鱼、带鱼、大黄鱼、东星斑鱼8种鱼类DNA进行等浓度(10 ng/μL)混合，利用鱼肉通用引物进行扩增，扩增条件同“1.2.2”所述，将PCR产物与芯片进行杂交反应，用无菌水作空白对照。

1.2.5可视芯片灵敏度分析将已测定浓度的多宝鱼、银鲳鱼、金枪鱼、暗纹东方鲀、青石斑鱼、带鱼、大黄鱼、东星斑鱼等8种鱼肉DNA，用无菌水稀释至10 ng/μL，取10 μL 10 ng/μL DNA至90 μL无菌水中，得到1 ng/μL的DNA浓度，由此依次类推得到0.1、0.01、0.001 ng/μL的DNA浓度。按照“1.2.2”条件进行PCR扩增，扩增产物分别与芯片进行杂交反应，用无菌水作空白对照。

1.2.6市售样品检测为确证可视芯片方法的准确性及适用性，选取7份市售鱼肉加工样品：鲜得味金枪鱼罐头、伊纳宝金枪鱼罐头、五香黄花鱼罐头、三文鱼松、古龙茄汁沙丁鱼、石斑鱼肉、东星斑鱼肉，DNA提取后按照“1.2.2”条件进行扩增，PCR产物分别与芯片进行杂交反应，将检测结果与样品标签进行比对。

2 结果与讨论

2.1 引物及探针设计

目前常用于鱼肉种类鉴别的基因有线粒体COI基因、CR区段以及16S rDNA等，但经序列比对发现这些基因并不适用于同时设计8种鱼类的通用引物及特异探针。考虑到作为鱼类主要过敏原的小清蛋白不仅广泛存在于鱼类骨骼纤维中，而且具有物种特异性，现已成为研究不同物种之间亲缘关系的重要工具[19]，因此选择小清蛋白基因作为鱼肉种类鉴别的靶标基因。

首先自行克隆测序了暗纹东方鲀(T.obscurus)、东星斑鱼(C.miniata)、青石斑鱼(H.indigo)、多宝鱼(P.lethostigma)、大黄鱼(L.xanthurus)、银鲳鱼(P.argenteus)以及带鱼(T.haumela)的小清蛋白基因序列，提交GenBank数据库后分别获得序列号MF671767、MF671768、MF671769、MF671770、MF671771、MF671772、MF671773。同时从GenBank数据库下载金枪鱼的小清蛋白基因序列(GenBank：FN544082.1)。采用生物信息学软件ClustralX比对不同品种鱼的小清蛋白基因序列，在基因保守区设计了鱼通用引物，在非保守区设计了不同品种鱼的特异性探针。序列比对结果如图2所示。

图2 鱼类小清蛋白基因序列比对结果Fig.2 The results of the sequence alignments of parvalbumin gene in fishthe nucleotides followed arrows indicate the position of fish universal forward and reverse primer，the specific probes for eight fish species are shown in red color(箭头对应序列代表鱼的通用正/反向引物序列，红色加粗标记序列代表特异性探针序列)

2.2 可视芯片特异性结果

图3 单组分鱼肉可视芯片特异性结果Fig.3 Specificity detection result of single-fish species on thin-film biosensor chips1.Turbot；2.Silvery pomfret；3.Tuna；4.Obscura puffer；5.Indigo hamlet；6.Hairtail；7.Large yellow croaker；8.Miniatus grouper

图4 多组分鱼肉可视芯片特异性结果Fig.4 Specificity detection result of multiple-fish species on thin-film biosensor chips1.Turbot；2.Silvery pomfret；3.Tuna；4.Obscura puffer；5.Indigo hamlet；6.Hairtail；7.Large yellow croaker；8.Miniatus grouper

2.2.1单组分鱼肉特异性分析依照实验预先设计的十字型芯片图案，阳性对照位点全部呈现明显的信号，多宝鱼、银鲳鱼、金枪鱼、暗纹东方鲀、青石斑鱼、带鱼、大黄鱼、东星斑鱼8种鱼的靶标探针位点也均呈现明显信号，与阳性对照的信号相当，且与背景信号明显区分，而同一张芯片上的其他非靶标探针位点则完全与背景一致，没有任何信号(图3)，说明本研究设计的探针可特异性检出多宝鱼、银鲳鱼、金枪鱼、暗纹东方鲀、青石斑鱼、带鱼、大黄鱼以及东星斑鱼成分。

2.2.2多组分鱼肉特异性分析图4是可视芯片高通量检测鱼类的特异性结果。芯片中阳性对照的信号全部清晰显现，所有鱼类探针位点的信号明显，均可与背景清晰地区分，说明该方法可同时检出8种鱼类成分。实验也发现，不同鱼的探针位点杂交信号强度存在差异性，其原因可能是靶标基因扩增产物与特异探针的杂交反应受到其他扩增产物或探针的干扰，但检测信号与背景均可明显区分，不影响其高通量检测8种鱼类的准确性，且整个可视芯片检测过程仅需约35 min。相比一次扩增只能检测1个物种的实时荧光PCR方法、LAMP方法等，该方法具有明显的通量优势；相较通量更高的测序技术，其优势在于结果肉眼可见，检测时间短，一般测序技术上机检测1个样本至少需2～3 h，且测序数据需经序列比对才能获得最终检测结果，耗时较长，数据分析专业性较强。

图5 多宝鱼的可视芯片灵敏度检测结果Fig.5 The detection limit result of Turbot on thin-film biosensor chips1-5：10，1.0，0.1，0.01，0.001 ng/μL

2.3 可视芯片灵敏度结果

将多宝鱼、银鲳鱼、金枪鱼、暗纹东方鲀、青石斑鱼、带鱼、大黄鱼以及东星斑鱼DNA分别稀释至10、1.0、0.1、0.01、0.001 ng/μL，将其PCR产物与可视芯片分别进行杂交反应。以多宝鱼为例，当DNA为0.01 ng/μL时，芯片上特异结合位点产生微弱信号，当DNA为0.001 ng/μL时，芯片上特异结合位点无信号产生，与背景颜色一致，表明方法检测多宝鱼的灵敏度为0.01 ng/μL(图5)。同样，得到银鲳鱼、暗纹东方鲀、带鱼、东星斑鱼的检测灵敏度为0.01 ng/μL，青石斑鱼、金枪鱼以及大黄鱼的检测灵敏度为0.1 ng/μL。

2.4 市售样品检测结果

为验证方法的可行性，利用已建立的可视芯片方法对7份市售样品开展多宝鱼、银鲳鱼、金枪鱼、暗纹东方鲀、青石斑鱼、带鱼、大黄鱼以及东星斑鱼等成分的检测，结果见表2。两份金枪鱼罐头均检出标识的金枪鱼成分，东星斑鱼肉检出标识的东星斑鱼成分，说明该检出结果与标签一致；五香黄花鱼罐头检出大黄鱼成分，石斑鱼肉检出青石斑鱼成分，但样品标签中未明确标识大黄鱼、青石斑鱼成分；三文鱼松以及古龙茄汁沙丁鱼两份样品标签中无上述8种鱼成分标识，且样品中也均未检出8种鱼类成分。以上说明，本研究建立的可视芯片方法可用于市售鱼肉样品中8种鱼源性成分的检测。

表2 市售样品的检测结果Table 2 The detection results of commercial products

+：detected；-:no detected

3 结 论

针对鱼肉市场常见的鱼类品种掺假问题，本研究以多宝鱼、银鲳鱼、金枪鱼、暗纹东方鲀、青石斑鱼、带鱼、大黄鱼以及东星斑鱼8种鱼类为研究对象，根据小清蛋白基因序列设计了8种鱼的通用引物以及特异性探针，利用可视芯片技术建立了一种快速、准确、灵敏、便捷的可同时检测8种鱼类的高通量检测方法，为我国鱼肉市场的安全监管以及检验检疫口岸的现场快速通关提供了新的技术支撑。

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