血清miR-208a水平与急性心肌梗死后左室重构的相关性研究

罗晓星

(解放军第458医院，广东 广州 510062)

急性心肌梗死(AMI)发生后，由于心室肌在缺血、缺氧等损害因素的持续作用下，导致左心室形态和大小的改变称为左室重构(LVR)。LVR的发生不仅导致AMI患者的心脏功能严重受损，还直接影响预后。因此，能够早期发现、预测AMI患者发生LVR，对于及时治疗或延缓LVR的发生、改善AMI患者预后具有非常重要的意义[1]。MicroRNA(miRNA)是广泛存在于真核生物细胞中的一类内源性的、非编码的单链小分子RNA，具有调控多个上游基因表达和下游蛋白翻译的能力[2]，因而在多种生理病理过程起着非常重要的作用。miR-208是在心肌组织中特异性表达的miRNA，其与心脏的发育等生理病理过程密切相关[3-4]。大规模、多中心临床实验发现miR-208是影响AMI患者心源性死亡和心脏衰竭的独立危险因素[5-6]。目前对miR-208a与AMI后LVR相关性以及相关机制的研究较少，临床上用于诊断AMI患者发生LVR的血清学指标尚无统一标准。本研究通过检测AMI患者血清miR-208a水平，研究其与AMI患者发生LVR的相关性，初步探讨血清miR-208a对AMI患者近期发生LVR的预测价值。

1 临床资料

1.1一般资料 选择2013年1月—2015年1月我院心血管内科和干部病房诊治的明确诊断为AMI患者60例，其中男48例，女12例；年龄(47.9±6.5)岁。均符合中华医学会心血管病分会制定的AMI诊断标准，首次发作，在发病后24 h内入院；患者及其家属明确知晓且签署知情同意书，且经医学伦理委员会批准。排除其他各种原因导致的非AMI性心脏疾病者；合并脑、肺、肝、肾严重疾病者；合并晚期恶性肿瘤者；严重急慢性感染性疾病者；意识或精神原因不能配合者。另选择同期30例健康体检者作为健康对照组，男22例，女8例；年龄(45.3±5.9)岁，所有受试者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1超声数据检测采集 分别于入院时及发病后6个月采用PHILIPS IE33彩色多普勒超声诊断仪进行超声数据检测采集。受检者左侧卧位，在二维图像下获得心脏左室胸骨旁长轴在二尖瓣腱索水平的M型图像，于呼气末期测出舒张末期(QRS波起点)左室舒张末内径(EDD)、左室后壁厚度(LVPWT)和室间隔厚度(IVST)，测量5个心动周期取平均值。根据Devereux公式[7]计算左室质量(LVM)和左室质量指数(LVMI)，根据发病6个月后LVMI将AMI患者分为左室重构组34例和非左室重构组26例。LVM=1.04×[(EDD+IVST+LVPWT)3-EDD3]-13.6(g)；LVMI=LVM/BSA(体表面积)(g/m2)。BSA=[0.006×身高(cm)+0.012 8×体质量(kg)]-0.152 9。LVR诊断标准：LVMI≥125 g/m2(男性)或≥120 g/m2(女性)。

1.2.2血清样本采集 采集AMI患者发病后24 h内外周静脉血5 mL，健康对照组取空腹外周静脉血5 mL，室温下静置1 h，置于4 ℃，3 000 r/min离心15 min，取上层血清，集中统一编号后置于-80 ℃冰箱待测。

1.2.3实时荧光定量PCR ①血清总RNA提取：采用Trizol试剂对血清总RNA进行提取。经过RNA分相、沉淀、洗涤、溶解后，RNA电泳检测提取RNA分子的完整性，Nanodrop® ND-1000测定提取RNA的浓度。②逆转录(RT)反应：按照miScript Reverse Transcription Kit操作步骤构建10 μL反应体系，即RNA 3 μL， 1×mirVana RT Primer 1 μL，Array script Enzyme Mix 0.4 μL，mirVana RT Buffer(5×)2 μL，加RNase-free water至总体积10 μL。反应条件：37 ℃，15 min；42 ℃，50 min；85 ℃，5 min。③实时荧光定量PCR反应：按照miRNA SYBR Green PCR Kit 操作步骤构建20 μL反应体系，即5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4 μL， PCR Forward Primer(20×) 1 μL，PCR Reverse Primer(20×) 1 μL，1×cDNA模板1～2.5 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，加入ddH2O至总体积20 μL。 反应条件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个PCR循环。反应结束后分析PCR反应曲线，根据实时荧光定量PCR得出miRNA-208a与U6从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数(CT值)，采用2-ΔΔCT法对miR-21表达相对值进行分析。miR-208a正向引物序列：F-TGCGGTATAAGACGAGCAAA。

2 结 果

2.1AMI患者miR-208a表达水平 健康对照组人群血清miR-208a相对表达水平为0.177±0.034， AMI患者发病后24 h内血清miR-208a相对表达水平为1.405±0.295，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。左室重构组患者AMI发病后24 h内血清miR-208a相对表达水平为1.728±0.314，而非左室重构组患者AMI发病后24 h内血清miR-208a相对表达水平为1.086±0.289，2组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2miR-208a表达水平与LVR相关性 Pearson相关分析结果显示，miR-208a水平与LVMI间呈正相关(r=0.539，P<0.05)。见图1。

图1 血清miR-208a表达水平与左室重构程度相关性

2.3血清miR-208a表达水平对LVR的预测价值以AMI患者的LVMI为因变量，血清miR-208a表达水平作为自变量进行线性回归分析。结果显示血清miR-208a表达水平与LVR具有相关性(B=0.205，OR=0.930，P=0.01)，血清miR-208a表达水平越高，AMI患者发生LVR的可能性越大。

2.4血清miR-208a表达水平对LVR的诊断效能ROC曲线分析结果显示，miR-208a曲线下面积(AUC)为0.73(P<0.001)；取相对表达值1.704为截断点，血清miR-208a预测AMI患者发生LVR的灵敏度为82.64%，特异度为77.42%。见图2。

3 讨 论

AMI后患者发生LVR的具体机制十分复杂，已知与心肌细胞的凋亡、神经内分泌系统激活、免疫系统活化、细胞因子释放、相关信号通路激活和基因的异常表达等有关，目前尚未完全明确。据多个临床研究中心长期随访研究发现，LVR能够较为敏感地反映AMI发生后患者心功能情况，也是影响AMI患者远期发生心源性死亡的重要危险因素[8-9]。目前国内外医学界针对预测AMI后患者发生LVR的独立和敏感地血清标志物已开展了大量的研究，也取得了一定的成果。Dominguez等[10]对一组161例AMI患者进行前瞻性调查研究发现，AMI后发生LVR患者血清中褪黑素水平明显低于未发生LVR的患者。多元分析提示血清褪黑素水平是预测AMI后患者发生LVR的独立预测因子。Fertin等[11]通过对246例AMI研究发现，AMI患者血清MMP-8水平与左心室舒张末期容积(LVEDV)呈明显正相关；进一步单因素和多因素分析显示，血清MMP-8水平是AMI后发生LVR的独立预测指标。郭潮等[12]研究发现，AMI患者血清生长分化因子-15(GDF-15)水平与LVMI呈明显正相关，而与射血分数、相对室壁厚度呈明显负相关；提示血清GDF-15水平能反映AMI患者LVR程度。虽然已经有多个能够反映AMI后发生LVR的标志物，但这些标志物对LVR的预测价值存在一定的局限性。因此，如何针对AMI后患者发生LVR的相关机制进行深入研究，以及针对机制寻找能够较早的预测LVR的独立标志物和开发特效新药，仍然是目前临床医学界研究的重点。

图2 血清miR-208a的ROC曲线

miRNA是近年来新发现的一类内源性非编码的短链小RNA分子，其主要通过与目标mRNA 3’端非编码区相互补匹配(完全互补或者几乎完全互补)，在转录后调控目标基因。研究证实miRNA具有调控多个靶点基因的能力，其在机体的多种生理病理过程起着非常重要的调控作用[13]。由于miRNA在组织循环中相对稳定又具有生物遗传和种属表达保守性的特点，因此，医学上针对miRNA开展了一系列疾病监测和靶向治疗研究。

miR-208a为在心肌组织中特异性表达的miRNA。生理情况下，miR-208a在心肌干细胞的分化、心肌细胞肌球蛋白含量、肌纤维的成分及心肌细胞收缩性能上起着重要的调控作用[3]。病理情况下，心肌细胞中miR-208a的表达失调则与心肌胶原的堆积、心肌重构、心肌肥大、心律失常等心脏损伤过程密切相关[14-15]。且由于miR-208a具有高度组织特异性，目前很多研究认为心肌组织中异常高表达的miR-208a是一个强有力的预测心脏衰竭和心源性死亡的分子指标[16]。

本研究显示，AMI患者血清miR-208a表达水平显著高于健康对照组，这与国内外相关研究数据是一致的[17]。左室重构患者血清miR-208a表达水平显著高于非左室重构患者。Pearson相关分析显示，血清miR-208a水平与LVMI间呈显著正相关。线性回归分析显示血清miR-208a水平与LVR具有独立相关性。以上研究结果提示血清miR-208a表达水平越高，AMI患者发生LVR的可能性也越大，即高表达的血清miR-208a 是AMI患者发生LVR 的独立预测因子。

为研究miR-208a对AMI后患者发生LVR的诊断效能，本研究以反映左室重构程度的LVMI为因变量，对血清miR-208a水平进行ROC曲线分析。ROC曲线是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标，其曲线下面积越大诊断准确性越高。结果显示，miR-208a曲线下面积为0.73(P<0.001)；取相对表达值1.704为截断点，血清miR-208a预测AMI患者发生LVR的灵敏度为82.64%，特异度为77.42%。可见血清miR-208a对AMI后发生LVR具有较高的诊断价值。

综上可见，血清miR-208a与AMI后LVR的发生具有相关性，具有作为预测AMI后发生LVR的分子标志物的条件。但需进一步进行大样本及延长随访时间来进行验证研究。此外，尚需要更多的基础及临床试验进一步验证及阐明其相关机制。

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