非典型抗中性粒细胞细胞质抗体在自身免疫性疾病中的检测效果*

蔡 枫，蒋麒俊，谷丽华，李 岚

(上海中医药大学附属市中医医院检验科 200071)

抗中性粒细胞细胞质抗体(ANCA)是一类以单核细胞细胞质及中性粒细胞为靶抗原的自身抗体，存在于众多自身免疫性疾病及炎性疾病中[1]。抗-髓过氧化物酶(MPO)和抗-蛋白酶3(PR3)是2种典型的ANCA，在系统性红斑狼疮(SLE)、溃疡性结肠炎(UC)等疾病中具有较高的阳性率[2]。然而，部分患者可表现为ANCA阳性，抗-MPO和抗-PR3阴性，部分学者认为该患者可能存在某些非典型ANCA。目前，关于非典型ANCA的研究较少，且缺乏临床调查的研究数据[3]。本研究旨在探究非典型ANCA抗原谱与疾病的相关性，为临床诊断及预后提供指导意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011年12月至2016年9月本院门诊及住院收治的自身免疫性疾病或炎性疾病患者1 963例，其中男191例、女1 772例，年龄10～87岁，中位年龄为45岁。纳入标准：(1)年龄≥10岁，男女不限；(2)符合1997年美国风湿病学会的诊断标准[4]。排除标准：(1)合并严重高血压、糖尿病及重要器官功能不全等内科慢性疾病；(2)合并神经精神类疾病。疾病类型包括：1 128例SLE，386例干燥综合征(SS)，296例类风湿关节炎(RA)，24例UC，39例皮肌炎(DM)，60例强直性脊椎炎(AS)及22例自身免疫性肝炎(AIH)。另取同期参加体检的志愿者50例作为健康对照组，其中男20例，女30例，年龄35～65岁，中位年龄为50岁，均排除自身免疫性疾病或炎性疾病，且无自身免疫疾病家族史。2组一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 间接免疫荧光法(IIF)检测试剂 采用粒细胞马赛克检测试剂盒(购于德国欧蒙医学试验诊断有限公司)，试剂检测区包括猴肝组织、人喉癌上皮细胞、甲醛固定的粒细胞及乙醇固定的中性粒细胞等4种生物薄片。

1.2.2 蛋白印迹(WB)检测试剂 采用WB抗-MPO、抗-PR3和抗-肾小球基底膜(GBM)免疫球蛋白G(IgG)检测试剂盒(购于德国欧蒙公司)，试剂盒中平行放置抗原高度纯化的检测膜条。

1.2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂 本研究ANCA谱选取6种典型及非典型抗体，包括：抗-MPO、抗-PR3、抗-GBM、抗-LF，抗-人白细胞弹性蛋白酶(HLE)、抗-组织蛋白酶G(CG)及抗-杀菌性/通透性增加蛋白(BPI)。微孔板ELISA检测试剂盒(购于德国欧蒙公司)。

1.2.4 荧光显微镜 采用德国EUROStar Ⅱ型荧光显微镜。

1.3 方法

1.3.1 IIF检测ANCA 严格按照操作说明，将研究对象血清1∶10稀释后25 μL滴于生物薄片上，22～24 ℃环境下反应20 min，在磷酸缓冲盐溶液(PBS)缓冲液中浸泡2 min，加入兔抗人IgG，避光放置20 min，再用PBS缓冲液浸泡2 min，甘油封片。同样方法加作阴性及阳性对照，阳性对照包括核周型ANCA(p-ANCA)和细胞质型ANCA(c-ANCA)。

1.3.2 WB检测ANCA 将血清1∶10稀释后1.5 mL滴加于抗-MPO、抗-PR3和抗-GBM抗原高度纯化的检测膜条上，室温下均匀摇荡10 min，后用PBS缓冲液洗涤3次，加入同为1∶10稀释的酶结合物1.5 mL，再次摇荡、洗涤后加入底物温育20 min，最后洗涤3次，待干燥后按照说明书中的判定标准观察结果。

1.3.3 ELISA检测非典型ANCA 部分患者IIF检测结果为阳性，但抗-MPO及抗-PR3检测结果为阴性。对此，部分患者血清采用ELISA进行其他靶抗原的检测，具体操作严格按照说明书中的操作流程。

1.4 观察指标 记录各疾病种类ANCA的阳性率及靶抗原种类，比较典型ANCA与非典型ANCA患者的一般资料的差异，包括：性别比、年龄、疾病种类和病程。病程分为短期(初次就诊且病程<12个月)和长期(病程≥12个月)。

2 结 果

2.1 IIF和WB检测结果 共361例患者检测ANCA阳性。各疾病按照阳性率由高到低排列依次为SLE、UC、SS、RA和AS。样本量较少的DM、AIH与健康对照组50例ANCA均为阴性。见表1。

表1 IIF和WB检测结果

2.2 非典型ANCA检测结果 ANCA检测阳性，而抗-MPO和抗-PR3检测阴性共121例，应用ELISA对其行非典型ANCA确认试验，结果显示其中24例抗-LF阳性，3例抗-BPI阳性，1例抗-弹性蛋白酶阳性。

2.3 典型与非典型ANCA患者一般资料比较 收集330例典型ANCA与30例非典型ANCA患者的一般资料，经统计学处理，2组在性别比、年龄、疾病种类和病程方面差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 典型与非典型ANCA患者一般资料比较

3 讨 论

目前，关于非典型ANCA的研究较少，缺乏临床调查的研究数据[5]。非抗-MPO、非抗-PR3的ANCA抗体相关疾病谱较复杂，可涉及风湿免疫性疾病、原发性硬化性胆管炎(PSC)和炎性肠病(CIBD)，尚不清楚ANCA抗体是否为小血管炎等疾病发病病因或是否仅为发病所伴发的现象或后果[6]。已知的非抗-MPO、非抗-PR3的ANCA抗体靶抗原有多种，其中既有细胞质抗原，又有核抗原。靶抗原主要有乳铁蛋白、组织蛋白G、弹性酶、溶菌酶、细菌通透性增加蛋白、过氧化氢酶、α-烯醇化酶、高迁移率族蛋白、组蛋白1、板层素B1等等[7]。有研究发现，CIBD患者即使IIF检测结果为阴性的血清标本，也有一定比例的靶抗原检出率[8]。因此，进行非典型ANCA抗原谱与疾病的相关性研究对临床诊断、病情活动、疗效及预后判断等具有重要意义[9]。本研究选取1 963例确诊为自身免疫性疾病和炎性疾病的患者，通过IIF、WB和ELISA等3种检测手段，分析不同靶抗原的ANCA所对应的疾病谱，旨在探究典型与非典型ANCA与疾病的相关性。

从本研究结果来看，共361例患者检测ANCA阳性。各疾病按照阳性率由高到低排列依次为SLE、UC、SS、RA、AS，这与刘义庆等[10]的研究结果一致。样本量较少的DM、AIH与健康对照组50例ANCA均为阴性。选取ANCA检测阳性，而抗-MPO和抗-PR3检测阴性共121例，均为p-ANCA型，应用ELISA对其行非典型ANCA确认试验，结果显示，其中24例抗-LF阳性，3例抗-BPI阳性，1例抗-弹性蛋白酶阳性。LF和BPI在机体免疫中发挥抗炎作用，笔者推测该特异性靶抗原可能参与了炎性反应过程。典型与非典型ANCA患者在性别比、年龄、疾病种类和病程方面差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究在试验过程中存在一定技术上的难点，由于许多自身免疫性疾病患者血清中存在抗核抗体(ANA)，应用IIF检测ANCA时，ANA有时会干扰试验结果，特别是荧光染色表现为均质型的ANA，会进一步增加结果判断难度。因此，在筛选ANCA阳性，抗-MPO和抗-PR3阴性患者时需要检测人员具备良好的经验。

本研究存在以下2点不足：(1)研究对象疾病种类受限，且某些疾病样本量过小，导致其无ANCA阳性患者，因此结果在一定程度上存在局限性；(2)目前已知的靶抗原种类较少，且受限于试验材料，仍有许多患者ANCA阳性却未找到相应靶抗原，有待于进一步研究。

综上所述，自身免疫性疾病或炎性疾病患者血清ANCA阳性率较高，继续采用ELISA进行针对性筛查发现绝大部分靶抗原为抗-MPO和抗-PR3，少数患者存在抗-LF和抗-BPI等非典型ANCA。

[1]蔡枫,谷丽华,夏莉婷.抗中性粒细胞胞浆抗体检测在自身免疫性疾病中的应用[J].放射免疫学杂志,2013,26(4):464-466.

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