胱抑素C及其基因多态性与广西地区壮族人群冠心病的相关性*

朱 旭，郑利平，杨 兰，陆俊佳

(广西医科大学第三附属医院暨南宁市第二人民医院医学检验科 530031)

胱抑素C(Cys-C)是一种广泛存在于有核细胞和体液中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，可调节特异性组织蛋白酶的活性，在动脉粥样硬化(AS)疾病的发生发展过程中起重要作用。Cys-C基因突变可导致Cys-C表达改变，而Cys-C基因位点及其频率分布受人种、地域等因素影响较大。目前，国内外关于Cys-C基因多态性与冠心病(CHD)的关系研究结果尚不一致。本研究通过检测广西壮族、汉族CHD患者外周血清中Cys-C水平及Cys-C基因位点+148 G/A、+73 A/G和-82 G/C基因多态型，以及不同基因多态性分布频率，探讨广西壮族CHD与Cys-C水平及其3个基因位点关系，为CHD防治提供全新视角。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取广西壮族自治区南宁市(壮族主要分布区)的壮族CHD患者(壮族CHD组)、壮族健康志愿者(壮族健康组)、汉族CHD患者(汉族CHD组)和汉族健康志愿者(汉族健康组)各100例。壮族CHD组男54例、女46例，中位年龄为55.9岁；壮族健康组男53例、女47例，中位年龄为52.9岁；汉族CHD组男55例、女45例，中位年龄为58.3岁；汉族健康组男54例、女46例，中位年龄为54.4岁。研究对象入选标准：(1)3代以上皆与同民族通婚的壮族、汉族家族，选择最后一代个体为研究对象，且其尽可能在家族可追踪的历史上没有与其他民族通婚；(2)无其他急、慢性疾病史及遗传性疾病家族史。CHD的诊断标准参照《CHD诊断标准》。排除标准：急性脑出血、脑梗死；所有感染，自身免疫性疾病，代谢性疾病(糖尿病除外)、肾脏疾病及使用激素；妊娠、肿瘤。采样前遵循知情同意原则，告知研究对象并确保研究对象间无血缘关系。收集所有研究对象的临床资料。本研究通过医院医学伦理委员会批准。4组研究对象性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 仪器与试剂 日立-7600全自动生化仪购于日本日立公司，ABI-9700扩增仪购于美国ABI公司，电泳仪购于北京六一仪器厂，凝胶成像仪购于珠海黑马生物公司；肌酐(Cr)、Cys-C试剂购于浙江伊利康生物技术有限公司，空腹血糖(FPG)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)等试剂购于罗氏公司；DNA抽提试剂购于北京天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 获取试验资料 抽取所有研究对象空腹静脉血5 mL，分别注入乙二胺四乙酸二钾盐(EDTA-K2)抗凝管(2 mL)及干燥管(3 mL)。抗凝管上下颠倒数次，充分混匀后，置于4 ℃冰箱短时(<7 d)保存，用于Cys-C基因3个位点的多态性检测。干燥管静置30 min， 3 000 r/min离心10 min，分离血清用于测定FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、Cr及Cys-C水平。

1.3.2 生化项目的检测 全自动生化仪测定所有研究对象血清中FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C 、Cr和Cys-C水平。所有项目测试前，均做室内质控，室内质控在控后，才可进行检测。

1.3.3 DNA提取 采用离心吸附柱法提取全血DNA，一切操作严格按照试剂说明书操作，提取好的DNA保存于-20 ℃冰箱中。

1.3.4 Cys-C基因检测 (1)引物序列和反应体系：根据GenBank提供的 Cys-C基因启动子序列，采用Primer 5.0软件设计引物。Cys-C基因+148、+73和-82位点引物序列，见表1。反应体系共50 μL：聚合酶链式反应(PCR)混合反应液8 μL(含dNTP、buffer)、Taq酶0.5 μL、DNA模版2 μL、上下游引物各1 μL和无菌水37.5 μL。

表1 Cys-C+148 G/A、+73 A/G和-82 G/C基因位点引物序列及内切酶

(2)Cys-C+148、+73 和-82基因位点的扩增条件及限制性片段长度多态性分析：94 ℃ 5 min预变性，94 ℃ 1 min、62 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s、35个循环，72 ℃延伸5 min 。限制性酶切反应：PCR后产物20 μL、内切酶1 μL，buffer 3μL，无菌水6 μL，37 ℃酶切1 h。在2%琼脂糖凝胶上点样5 μL酶切后产物，电压100 V，电泳30 min后凝胶图象分析仪下观察电泳结果，分析并摄像保存。Cys-C+148位点：产物为254 bp(A等位基因)，酶切后为132 bp和122 bp的2个片段(G等位基因)。Cys-C+73位点：产物为254 bp(A等位基因)，酶切后为63 bp和191 bp的2个片段(G等位基因)。Cys-C-82位点：产物长度为379 bp(C等位基因)，酶切后为200 bp和179 bp的2个片段(G等位基因)。

2 结 果

2.1 4组临床资料及Cys-C水平比较 4组间临床资料和Cys-C水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。壮族、汉族CHD组体质量指数(BMI)、FPG、收缩压、舒张压、TG、TC、LDL-C、Cys-C、Cr水平明显高于同民族健康组，而HDL-C明显低于同民族健康组，差异均有统计学意义(P<0.05)。壮族、汉族CHD组FPG、BMI、收缩压、舒张压、TG、TC、HDL-C、LDL-C、Cys-C及Cr水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 4组临床资料及Cys-C水平比较

注：与同民族健康组比较，*P<0.05

2.2 CHD组血清Cys-C水平与CHD其他危险因素的相关性 2个CHD组患者血清中Cys-C水平与CHD危险因素中的FPG、BMI、收缩压、舒张压、TG、TC、HDL-C、LDL-C无明显相关性(P>0.05)，但与Cr水平呈正相关(P<0.05)。见表3。

2.3 4组Cys-C基因分型结果 4组Cys-C+148、+73和-82基因位点的主要型别是野生型，壮族、汉族CHD组中Cys-C+148、+73基因杂合程度高于同民族健康组，而Cys-C-82基因位点杂合程度低于同民族健康组。经H-W平衡检验，4组的Cys-C+148、+73和-82基因位点差异均无统计学意义(P>0.05)，符合H-W群体遗传平衡法则，具有群体代表性。比较4组Cys-C+148、+73和-82不同基因型频率，Cys-C+73等位基因分布频率差异有统计学意义(P<0.05)，Cys-C+148和-82等位基因分布频率差异无统计学意义(P>0.05)。壮族、汉族CHD组的Cys-C+73G基因型分布频率均高于同民族健康组，差异有统计学意义(P<0.05)。汉族CHD组Cys-C+73位点G基因型分布频率与壮族CHD组不同，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。电泳结果见图1。

表3 Cys-C与CHD其他危险因素Spearman相关分析

表4 4组研究对象Cys-C的基因检测结果

2.4 CHD患者Cys-C+148、+73 A/G和-82 G/C基因型与血清Cys-C水平的关系 两民族所有CHD患者Cys-C+73位点不同基因型间血清Cys-C水平差异有统计学意义(P<0.05)。GG基因型患者Cys-C水平明显低于AG型和AA型，差异有统计学意义(P<0.05)；AG型与AA型间Cys-C水平比较差异无有统计学意义(P<0.05)。壮族、汉族CHD组患者Cys-C+73位点同一基因型间Cys-C水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。CHD患者Cys-C+148和-82位点不同基因型间血清Cys-C水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 CHD患者Cys-C+73和-82不同基因型的血清 Cys-C水平

续表5 CHD患者Cys-C+73和-82不同基因型的血清 Cys-C水平

注：与同组GG基因型血清Cys-C水平比较，#P<0.05

注：23、24、26分别为Cys-C+73 GG、AG、AA基因型；27、28、29分别为Cys-C-82 GG、GC、CC基因型；30、31、32分别为Cys-C+148 GG、GA、AA基因型

图1 Cys-C+148 G/A、+73 A/G和-82 G/C电泳图

3 讨 论

Cys-C表达于所有有核细胞，参与机体众多生理和病理过程。除了可作为评价肾小球滤过功能的重要指标外[1]，Cys-C还通过与半胱氨酸抑素酶(如组织蛋白酶等)形成紧密的复合物，从而抑制半胱氨酸抑素酶的活性，影响细胞外基质产生和降解的动态平衡。同时，Cys-C可影响粒细胞的吞噬及趋化作用，参与AS的发生、发展。有研究表明，Cys-C水平与CHD的发生有密切关系。Cys-C水平降低时，其抑制半胱氨酸蛋白酶功能——尤其是组织蛋白酶的抑制功能下降，从而导致组织蛋白酶活性增强，造成病理性损伤，加速CHD的发生、发展[2-3]。 Cys-C编码基因位于染色体20p11.2，是胱抑素超家族中的成员。前瞻性队列研究发现，Cys-C基因发生突变可能引起机体Cys-C的合成和分泌水平减少，导致Cys-C酶活性的抑制功能减弱，引起机体生理、病理发生改变。Cys-C基因主要在基因启动子处发生突变，且其基因突变及分布频率受种族、地域影响。目前，国内外研究对Cys-C水平及基因多态性与CHD关系的结论尚不一致[4-6]。

本研究中，壮族、汉族CHD组血糖、血脂、血压和肾功能等指标较同民族健康组有明显差异，进一步证明了血糖、血脂、血压和肾功能等是CHD的危险因素。壮族、汉族CHD组外周循环中Cys-C水平明显高于同民族健康组，这与国内相关研究结果相似[7-8]，但与低水平Cys-C可促进AS发生、发展的结论相悖。壮族、汉族CHD组患者外周循环Cys-C水平高于同民族健康组，分析原因可能与CHD患者存在肾功能不全有关。本研究中壮族、汉族CHD组Cr水平高于同民族健康组，且Cys-C水平与Cr水平呈正相关。Cr水平升高时Cys-C测定结果亦升高，提示肾功能受损导致CHD患者外周循环中Cys-C水平升高。不过，本研究仅检测了CHD患者血清中的Cys-C水平，未检测动脉粥样硬化局部组织的Cys-C表达水平，不能判定局部血管组织Cys-C水平情况。

Cys-C+73位点A/G突变，可导致苏氨酸替换信号肽倒数第2位的丙氨酸。而Cys-C+148位点G/A突变却导致2-信号肽由苏氨酸转变为丙氨酸，而这些氨基酸的替换可影响Cys-C向高尔基复合体和内质网的输运，通过中断信号肽、影响成熟蛋白的断裂等方式来修饰Cys-C的加工途径，导致Cys-C分泌减少或活性降低。本研究发现，壮族、汉族CHD组Cys-C+73位点AG和GG基因型分布频率明显高于同民族健康组。进一步分析Cys-C+73不同基因型外周循环中Cys-C水平，发现G等位基因外周血中Cys-C水平降低，特别是GG基因型患者Cys-C水平明显降低。壮族、汉族CHD组患者Cys-C+73位点相同基因型外周循环中的Cys-C水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示Cys-C+73基因多态性导致的低水平Cys-C是广西壮族自治区壮族、汉族CHD患者的危险因素。CHD患者及健康人群Cys-C+148和-82位点的基因型和等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。分析原因可能是：(1)Cys-C+148和-82位点基因多态性不是广西壮族自治区的CHD候选基因位点，这与郭进京等[9]研究甘肃省CHD患者Cys-C基因多态性的结论相一致，但与国外研究结论不一致[10]；(2)Cys-C+148位点的A基因型和-82位点G基因型可能广西壮族自治区的壮族、汉族CHD发生、发展的一个危险因素，但因本研究观察的样本量仅为100例，加之纳入研究的个体可能存在选择误差，群体代表性还不够强，具有局限性，不足以检测出相关性。

综上所述，Cys-C+73位点基因多态性所致的低水平Cys-C可能是广西壮族自治区壮族、汉族CHD患者的易感因素，但肾功能不全引起的血清高Cys-C水平掩盖了上述现象。Cys-C+73基

因多态性与CHD的关系还需进一步对局部组织进行研究。

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