反复注射顺铂诱导小鼠慢性肾功能不全模型的建立

黄统生，郭赟，杨陈，安宁，叶霖，唐皓璇，黄希杰，许勇芝，潘庆军，刘华锋

(广东医科大学附属医院肾病研究所，湛江市慢性肾脏病防控重点实验室，湛江 524001)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是指各种原因引起的肾功能快速丢失为特点的临床综合征[1]。除具有较高的死亡风险外，AKI患者远期预后很差，常进展成慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)和终末期肾脏疾病(end stage renal disease, ESRD)[2]。由于AKI向CKD转化的机制尚未阐明，因此针对性的改善AKI转归的治疗方法仍十分缺乏。

目前可用于研究AKI向CKD转化时肾脏病理生理学改变和机制的动物模型非常少。缺血再灌注、肾毒性物质以及脓毒血症等刺激因素引起的AKI动物模型大多应用在急性期肾损伤研究，难以观察到AKI向CKD转化的过程。因此，需要建立一些更好地反映AKI向CKD转化过程的动物模型，以阐明AKI向CKD转化机制，研发针对性治疗策略。

顺铂(cisplatin)是临床上常用的治疗实体瘤的一种化疗药物,具有剂量依赖的肾毒性[3]。小鼠单次大剂量(>25 mg/kg)注射顺铂，可构建模拟肾毒性物质引起的AKI模型。但此模型导致肾损伤过于严重，动物死亡率高，无法用于AKI向CKD转化的相关研究[4]。既往报道庆大霉素可诱导大鼠肾小管间质纤维化模型[5]，还有通过口服腺嘌呤[6]、肾大部切除和肾梗死制备的大鼠5/6肾切除模型[7]、单侧输尿管梗阻模型[8]等方法建立慢性肾功能不全的动物模型。此外，Daisuke等[9]报道了顺铂可导致肾小管间质纤维化。结合既往研究报道，我们在本实验中，采用小剂量反复注射顺铂的方法，引起小鼠慢性肾功能不全的表现，有望为研究AKI向CKD的转化机制提供了新的模型。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

本实验采用SPF级雄性C57BL/6小鼠(8周龄，体重22～23 g)作为实验对象，由广东省实验动物中心提供【SCXK(粤)2013-0002】，饲养于广东医科大学实验动物中心屏障环境中【SYXK(粤)2015-0147】，环境温度为(25±2)℃，湿度为50%～70%，12 h光照阴暗交替。本实验得到广东医科大学动物伦理委员会许可(伦理审查批准编号：GDY1702001)，所有动物实验操作均按照广东医科大学实验动物中心的操作指南执行，并符合中华人民共和国《实验动物管理条例》。

1.1.2 试剂

顺铂和天狼星红染料购买于美国Sigma公司；肌酐检测试剂盒和N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAG)试剂盒购买于南京建成生物科技有限公司；山羊抗肾损伤分子1 (kidney injury molecule 1， KIM-1)抗体购买于美国R&D公司，兔抗CD3抗体和兔抗胶原Ⅰ抗体购买于美国Abcam公司，大鼠抗小鼠F4/80抗体购买于美国Bio-Rad公司 (MCA497GA)；DAB显色试剂盒、辣根过氧化物酶标记的驴抗山羊IgG抗体和山羊抗兔IgG抗体均购买于碧云天生物科技公司，Alexa594标记的驴抗大鼠IgG抗体购买于美国Invitrogen公司(A-21209)，DAPI试剂购买于中国Beyotime公司(C1005)。其他试剂均购自国内外知名试剂公司，化学试剂至少为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 反复注射顺铂造模

24只C57BL/6雄性小鼠随机分成对照组(CON组)、顺铂低剂量组(LD 组)、顺铂中剂量组(MD 组)以及顺铂高剂量组(HD 组)，共4组，每组6只小鼠。顺铂组按体重采用腹腔注射顺铂，低剂量为5 mg/kg，中剂量为7 mg/kg，高剂量为10 mg/kg，每周1次，连续注射4周。于每周注射后3 d收血液和尿液标本备检。于第4次注射后3 d处死小鼠，留取血液、尿液以及肾组织标本待检。

1.2.2 尿液收集和相关检测

小鼠置代谢笼中收集24 h尿液标本。尿液经4000 r/min离心15 min，去除尿沉渣，-20℃保存。采用Bradford法检测小鼠尿液蛋白水平，结合尿量计算小鼠24 h尿蛋白排泌量。利用试剂盒检测小鼠尿液NAG水平。

1.2.3 血肌酐的检测

采用尾静脉采血每周收集小鼠少量血液标本。实验终点采血方法：动物麻醉后，心脏取血约1 mL，4℃静置于EDTA-Na2抗凝管30 min后, 4000 r/min离心15 min,分离出血浆，-80℃保存。按照血肌酐检测试剂盒说明书的步骤，检测小鼠血浆肌酐浓度。

1.2.4 肾脏病理染色

肾组织经甲醛固定24 h后，梯度脱水，进行常规石蜡包埋并切片。石蜡切片经PAS染色(periodic acid-Schiff staining)后,在显微镜下观察并进行肾小管损伤评分。损伤指标包括坏死细胞、刷状缘脱落、管型及小管扩张。按照每个200倍镜视野下,损伤指标所占面积百分比评分，评分标准为0分：0～5 %，1分：5%～10%，2分：11%～25 %，3分：26%～45 %，4分：46%～75 %；5分：>76 %。采用双盲随机分析方法，取5个视野平均值进行评估分析[10]。

1.2.5 免疫组化染色

检测肾组织中KIM-1、胶原Ⅰ和CD3的表达。石蜡切片脱蜡水化后，利用枸橼酸修复液进行高压抗原修复，然后过氧化氢封闭内源性过氧化物酶；接着用含正常血清的磷酸盐缓冲液封闭切片，再滴加抗KIM-1抗体(按1∶100稀释)或抗CD3抗体(按1∶50稀释)或抗胶原Ⅰ抗体(按1∶100稀释)，4℃过夜，用磷酸盐缓冲液代替一抗做空白对照。第二天，切片清洗后，滴加相应二抗(按1∶200稀释)，DAB显色，梯度酒精脱水、封片，显微镜下观察结果。KIM-1、胶原Ⅰ和CD3抗体检测在肾组织中出现棕黄色染色为阳性。每张切片于200倍镜下随机选取5个视野，用Image J软件照相并对KIM-1和胶原Ⅰ免疫组化染色进行分析，以面积表示KIM-1和胶原Ⅰ阳性表达的相对含量。每张切片于200倍镜下随机选取5个视野，统计CD3表达阳性的T细胞数。

肾组织切片进行天狼星红染色，梯度酒精脱水、封片，显微镜下观察。每张切片于200倍镜下随机选取5个视野，用Image J软件拍照并对天狼星红染色进行分析，以面积表示天狼星红染色阳性的的相对含量。

1.2.6 免疫荧光染色法

冰冻组织切片经磷酸盐缓冲液清洗后，用含2.5%牛血清白蛋白的缓冲液封闭30 min，滴加抗F4/80抗体(按1∶100稀释)，4℃过夜。次日清洗后，滴加荧光二抗(按1∶100稀释)，孵育1 h后，滴加DAPI染核，用抗荧光淬灭剂封片。利用磷酸盐缓冲液替代一抗做空白对照。荧光显微镜镜下观察。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况

顺铂高剂量组有1只小鼠死亡，其余各组小鼠均生存至实验终点。对照组小鼠体重平稳，而顺铂各剂量组小鼠体重较给药前均有下降。与注射顺铂前相比，顺铂高剂量组小鼠体重从第2周始至实验终点显著下降，差异有显著性(P<0.001)(图1)。此外，高剂量组小鼠一般情况较其他组差，表现为精神萎靡，毛发缺少光泽，及行动迟缓。

注：A.各组小鼠血浆肌酐浓度；B.各组小鼠24 h尿蛋白水平。与对照组比较，* P<0.05；*** P<0.001。CON代表对照组，LD代表顺铂低剂量组，MD代表顺铂中剂量组，HD代表顺铂高剂量组。图2 反复注射顺铂对各组小鼠血浆肌酐浓度和尿蛋白水平的影响Note. A: plasma creatinine. B: 24-hour urinary protein.Compared with the control group, * P<0.05.*** P<0.001. CON: Control group. LD: Low-dose cisplatin group. MD: Medium-dose cisplatin group. HD: High-dose cisplatin group.Fig.2 Effects of repeated administration of cisplatin on plasma creatinine and 24-hour urinary protein in the mice

注：与对照组比较， ***P<0.001。CON代表对照组，LD代表顺铂低剂量组，MD代表顺铂中剂量组，HD代表顺铂高剂量组。W代表周数。图1 反复注射顺铂对各组小鼠体重的影响Note. Compared with the control group, *** P<0.001. CON: control group. LD: low-dose cisplatin group. MD: medium-dose cisplatin group. HD: high-dose cisplatin group.W:weeks.Fig.1 Effect of repeated administration of cisplatin on body weight in the mice

2.2 各组小鼠血浆肌酐浓度和尿蛋白水平

与对照组相比，反复注射不同剂量顺铂均能引起小鼠血浆肌酐浓度上升和增加小鼠24 h尿蛋白排泌。其中顺铂高剂量组血浆肌酐浓度和24 h尿蛋白排泌量升高最为显著，与对照组相比差异有显著性(P<0.05)(图2)。

2.3 各组小鼠肾脏病理学变化情况

对照组小鼠肾脏组织肾小球和肾小管结构正常。肾小管细胞上皮细胞连接紧密、形态规则、排列整齐、边缘完整，细胞间隙未见水肿和炎症浸润。低剂量组病变较轻，偶见肾小管上皮细胞脱落；而中剂量组的肾组织皮质局部可见有肾小管上皮细胞刷状缘的脱落，基底膜部分裸露，炎性细胞浸润。高剂量组肾脏病变最重，肾组织皮质、皮髓交界可见大面积上皮细胞坏死，肾小管上皮细胞空泡变性、刷状缘消失、基底膜裸露、上皮细胞脱落及管型形成。

通过统计肾小管损伤评分发现，随着注射的顺铂浓度增加，肾小管损伤评分逐渐升高；高剂量组小管损伤显著高于对照组，差异有显著性 (P<0.01)(图3)。

注：A. 各组小鼠肾组织PAS染色(PAS×400, bar=50 μm)；B. 各组小鼠肾小管损伤评分与对照组比较，**P<0.01；与低剂量组比较，#P<0.01。CON代表对照组，LD代表顺铂低剂量组，MD代表顺铂中剂量组，HD代表顺铂高剂量组。图3 各组小鼠肾组织病理情况Note. A. PAS staining, bar=50 μm. B. Tubulo-interstitial damage score(±s). Compared with the control group, **P<0.01. Compared with the low-dose cisplatin group, #P<0.01. CON: Control group. LD: Low-dose cisplatin group. MD: Medium-dose cisplatin group. HD: High-dose cisplatin group.Fig.3 Pathological changes of kidney tissues in the mice

2.4 各组小鼠肾小管损伤标记物KIM-1表达和尿液NAG水平

通过免疫组化检测肾小管损伤标记物KIM-1的表达以及试剂盒检测尿液NAG的活性，进一步明确各组小鼠肾小管损伤情况。如图4所示，与对照组相比，随着顺铂注射浓度的增加，肾脏组织中KIM-1阳性肾小管数量逐渐增多，且顺铂高剂量组显著多于对照组，差异有显著性(P<0.05)。尿NAG水平的升高可以反应小管损伤情况。结果显示，与对照组相比，仅顺铂高剂量组小鼠尿NAG活性有所提升，但差异无显著性。

注：A.各组小鼠肾组织免疫组化KIM-1染色(IHC×400, bar=50 μm，黑色箭头为KIM-1的阳性表达肾小管；B.各组小鼠尿液NAG的活性与对照组比较，*P<0.05。CON代表对照组，LD代表顺铂低剂量组，MD代表顺铂中剂量组，HD代表顺铂高剂量组。图4 各组小鼠肾小管损伤情况Note. A. Expression of KIM-1 in the kidney tissue in each group (immunohistochemistry staining，× 400, bar=50 μm. Black arrows: KIM-1 positive expression in the tubules. B: KIM-1 positive expression area (%). C: Urinary NAG activity(±s). Compared with the control group, *P<0.05. CON represents the control group, LD represents low-dose cisplatin group, MD represents the medium-dose cisplatin group, and HD represents the high-dose cisplatin group.Fig.4 Changes of tubulo-interstitial damage of the mice in each group

2.5 各组小鼠肾脏CD3阳性T细胞和F4/80阳性巨噬细胞的浸润情况

免疫组化法检测各组小鼠肾组织CD3阳性T细胞和F4/80阳性巨噬细胞的浸润情况。结果发现，与对照组相比，反复注射不同剂量顺铂均能引起小鼠肾组织浸润的CD3阳性T细胞和F4/80阳性巨噬细胞增多(巨噬细胞主要分布在肾小管-间质周围，红色荧光，形态为狭长条形)，但差异无显著性(图5)。上述结果提示，反复注射顺铂引起T细胞和巨噬细胞的浸润可能参与肾脏病变进程。

注：A. 各组小鼠肾脏CD3阳性T细胞的表达；B. 各组小鼠F4/80阳性巨噬细胞的表达；C. CD3阳性T细胞的数量(IHC，×400，bar=50 μm)黑色箭头为CD3阳性细胞表达，黄色箭头为F4/80阳性细胞表达。CON代表对照组，LD代表顺铂低剂量组，MD代表顺铂中剂量组，HD代表顺铂高剂量组。图5 各组小鼠肾小管-间质炎症细胞浸润情况Note. A. Expressions of CD3 positive T cells in the kidney tissues (immunohistochemical staining). B. Expressions of F4/80 positive macrophages in the kidney tissues (immunofluorescence staining). C. Numbers of CD3 positive T cells (IHC, ×400，bar=50 μm，black arrows indicate CD3 positive cells, yellow arrows indicate F4/80 positive cells). CON represents the control group, LD represents the low-dose cisplatin group, MD represents the medium-dose cisplatin group, and HD represents the high-dose cisplatin group.Fig.5 Changes of tubulo-interstitial inflammatory cells in the mice of each group

2.6 各组小鼠肾脏纤维化情况

天狼星红染色可将肾组织的胶原蛋白染成亮红色，是检测器官纤维化的常用染色方法之一。如图6所示，对照组肾小管-间质可见少量天狼星红染色阳性的胶原组织。而与对照组相比，随着顺铂注射浓度的增加，肾脏组织中天狼星红染色阳性面积逐渐增多，且顺铂高剂量组显著多于对照组，差异有显著性 (P<0.001)。进一步利用免疫组化检测各组小鼠肾脏胶原I的表达情况发现，与对照组相比，随着注射的顺铂浓度增加，肾脏组织中胶原I染色阳性区域逐渐增多，且顺铂中剂量和高剂量组显著多于对照组，差异有显著性(P<0.05和P<0.01)。不仅如此，与对照组相比，随着注射的顺铂浓度增加，肾脏组织中表达肌成纤维细胞标记物α-SMA的细胞数量显著增加，高剂量组显著多于对照组，差异有显著性(P<0.01)。上述结果提示，反复注射顺铂可以引起小鼠肾脏发生纤维化。

注：A. 肾组织天狼星红染色；B. 肾组织胶原I免疫组化染色；C. 肾组织α-SMA免疫组化染色；D. 天狼星红染色的阳性表达面积；E. collagen I的阳性表达面积；F. α-SMA的阳性表达面积与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与低剂量组比较，# P<0.05，###P<0.001；与中剂量组比较，&&P<0.01。CON代表对照组，LD代表顺铂低剂量组，MD代表顺铂中剂量组，HD代表顺铂高剂量组。(IHC×400，黑色箭头为阳性表达，bar=50 μm)图6 各组小鼠的肾组织纤维化改变Note. A. Sirius red staining. B. Expression of collagen I. C. Expression of α-SMA. D. Sirius red positive expression. E. Collagen I positive expression. F. α-SMA positive expression.(±s).Compared with the control group, *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001; Compared with the low-dose cisplatin group, # P<0.05，###P<0.001; compared with the medium-dose cisplatin group, &&P<0.01. CON: Control group. LD: Low-dose cisplatin group. MD: Medium-dose cisplatin group. HD: High-dose cisplatin group.(immunofluorescence staining, ×400, black arrows indicate positive expression of tubulo-interstitial changes，bar=50 μm)Fig.6 Tubulo-interstitial fibrosis in the kidney tissue of the mice in each group

3 讨论

小鼠单次大剂量(20～40 mg/kg)注射顺铂可诱导严重的AKI模型，常用于研究AKI急性期病理学改变和机制，但由于肾损伤过重，小鼠易死亡，不适用于研究顺铂慢性肾毒性作用以及AKI向CKD转化相关研究。低剂量反复多次注射顺铂，更符合临床癌症化疗指南推荐的剂量和疗程，能模拟顺铂所致的肾脏长期慢性毒副作用，且小鼠死亡率低。本实验中，小鼠每周注射一次10 mg/kg的顺铂，连续注射4周，可诱导肾功能、病理生理改变均较符合临床CKD患者肾脏状态的CKD模型。

既往研究中，常利用大鼠作为顺铂诱导肾小管-间质纤维化模型的实验动物，但由于机制研究需要转基因操作，而大量现存的转基因动物以小鼠最多。因此，近年有课题组尝试在小鼠上构建此种模型。此前曾有报道C57BL/6背景小鼠不易产生纤维化[11]，而本实验所采用的方法成功诱导C57BL/6背景小鼠肾脏发生纤维化，表现为肌成纤维细胞数量增多和肾小管-间质胶原沉积增加，提示反复注射顺铂在C57BL/6背景小鼠上诱导慢性肾功能不全模型是可行的。此外，我们的模型也可以适用于小鼠的肿瘤模型使用顺铂长期治疗后的肾毒性研究。

顺铂所致AKI的主要受累的是近端小管的上皮细胞，引起细胞凋亡、坏死，此过程涉及T 细胞，T reg细胞，巨噬细胞等炎症细胞的浸润[12]。本实验中，反复注射10 mg/kg顺铂的模型组小鼠出现肾小管上皮细胞空泡变性、刷状缘消失、基底膜裸露、上皮细胞脱落及管型形成等病理学改变。慢性肾病的组织学特点, 例如:小管-间质纤维化、小管萎缩或扩张,小球结构基本完整，这些病变在本实验中均可见。目前认为，顺铂可引起肾小管上皮细胞线粒体功能障碍、DNA损伤、反应氧簇生成增多、凋亡、坏死等病变[13]，诱导肾小管-间质炎症反应，造成小管细胞严重损伤时则直接引起小鼠肾衰竭，甚至死亡。而损伤轻微时(如小剂量单次注射顺铂)，残存的小管细胞通过去分化、增殖、再分化的途径补充受损小管细胞，完成肾脏修复。有研究指出一旦小管细胞受到超出修复能力的持续打击，小管上皮细胞则停滞在细胞周期的G2/M期，产生促纤维化因子，如TGF-β增多，从而分泌胶原I和α-SMA等，诱导肾脏纤维化[14]。因此，肾小管上皮细胞损伤和修复是影响AKI转归的核心环节[15]。

本实验所采取的反复注射适量顺铂会引起小管细胞反复损伤，可能通过诱导其发生不恰当修复，参与慢性肾功能不全的病变进程。而反复注射顺铂引起肾小管上皮细胞高表达的KIM-1，可能是参与此过程的关键分子之一。研究发现，KIM-1可以促进顺铂的肾毒性病情发展[16]。在本实验中，反复注射10 mg/kg顺铂可诱导肾小管上皮细胞KIM-1表达显著升高。大量的文献证实，正常情况下，肾脏组织几乎不表达KIM-1蛋白，但是在肾脏损伤后数小时内的表达水平即显著升高，且其表达量随肾小管损伤范围的增加明显升高。KIM-1可诱导肾小管上皮细胞持续分泌多种促炎症因子，使肾脏处于活化的前炎症反应状态，进而诱导巨噬细胞及T细胞迁徙入肾间质，大量活化的炎症细胞促发肾脏炎症级联反应，最终导致肾间质炎症损伤及进行性纤维化加重[17-18]。我们对各组模型的肾脏组织进行CD3和F4/80染色，可以看到，模型组皮质和皮髓交界处有很明显的KIM-1表达，且小管间质可见CD3阳性T细胞和F4/80阳性巨噬细胞的浸润，提示反复注射顺铂引起小管细胞高表达的KIM-1可能是介导模型慢性炎症反应的关键分子。

众所周知，肾小管-间质纤维化是各种原因引起的CKD的共同的病理学变化，其损害程度与肾功能毁损程度密切相关是加速肾功能衰竭的主要驱动力。本实验中，反复注射顺铂引起小鼠肾脏肌成纤维细胞数量增多和肾小管-间质胶原沉积增加的纤维化病变。表达α-SMA的肌成纤维细胞是公认的强力产生细胞外基质，促进肾脏纤维化的关键细胞，其来源很广。有报道称，发生不恰当修复的可通过Twist和Snail介导的上皮细胞-间充质细胞转分化途径(epithelial-mesenchymal transition，EMT)转分化为肌成纤维细胞[19]，分泌大量胶原等细胞外基质，参与肾小管-间质纤维化[20]。此外，最近研究发现，在小鼠梗阻肾模型中，巨噬细胞通过转分化成肌成纤维细胞，参与肾脏纤维化[21-22]。而在体外实验，最近报道了M2型巨噬细胞可以协同成纤维细胞诱导顺铂条件下的肾小管上皮细胞EMT，促进肾小管-间质纤维化的进展[23]。本实验中，反复注射顺铂引起大量巨噬细胞浸润肾脏，极可能通过此途径参与后续肾小管-间质纤维化进程，可能还有更多的免疫细胞参与到这个过程，但尚需进一步实验证实，这为研究AKI向CKD转化的治疗提供了靶点。

本研究通过在C57BL/6小鼠上反复注射顺铂，引起小鼠肾小管损伤、肾脏T细胞和巨噬细胞浸润增多以及肾小管-间质纤维化病变，进而造成小鼠血肌酐上升和尿蛋白排泌增多，引起肾功能下降，炎症，纤维化等慢性肾功能不全的表现，有望为后续研究AKI向CKD的转化过程提供新的工具。此研究有一定的应用价值，可进行慢性肾功能不全的实验研究，如何保护肾功能、延缓甚至逆转肾功能的进展等热点。

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