外周血中Let-7e、微小RNA-206、微小RNA-605及微小RNA-1236表达与原发性高血压的相关性研究

李晶，马宇虹，杨凌

高血压是心血管疾病及其并发症的主要诱因，随着人们生活水平的提高及环境变化等因素的影响，高血压发病率逐年上升，且呈现低龄化[1]。微小RNAs (miRNAs)是一类进化上高度保守的18～25个核苷酸的单链小分子RNA，这类miRNA在动物中广泛存在，主要通过与靶 mRNA 的3'非翻译区（3'UTR）互补配对，负调控转录后蛋白翻译表达，参与多种生理病理过程，如细胞分化、增殖、炎症、免疫反应以及心血管病[2-4]。凝集素型氧化低密度脂蛋白受体（lectin-type oxidized LDL receptor 1, LOX-1）作为Let-7e的靶标之一，在高血压患者中会增加脂蛋白在血管中的滞留时间[5，6]；miRNA-206是肌肉特异表达的小RNA，与血管壁肌肉的发育有密切的关系，研究证明miRNA-206可以作为低氧诱导肺动脉高血压病发的标志物[7，8]；序列相似家族3成员A（Family with sequence similarity 3 A, FAM3A）作为miRNA-605的靶标之一，控制着PI3K-Akt信号通路，在调控肝脏葡萄糖和脂类代谢中发挥着激活的作用[9]；高血压通常伴有血管内皮生长因子（VEGF）的异常表达，血管内皮生长因子受体（VEGFR）作为miRNA-1236的靶标之一，是VEGF通路中重要的节点，影响心血管疾病的发展[9]。因此，本研究应用反转录实时定量法测定与心血管相关的Let-7e、miRNA-206、miRNA-605及miRNA-1236指标，探讨原发性高血压与miRNA表达量的关系，为原发性高血压患者治疗提供新的治疗靶标及思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择内蒙古自治区医科大学附属医院心血管科及老年病科2014-07到2016-12收治的169例原发性高血压患者（原发性高血压组），其中男性81例，女性88例，平均年龄（54.24±11.26）岁；同期选取143例体检健康者（正常对照组）作为研究对象，其中男性81例，女性62例，平均年龄（52.43±14.26）岁。高血压的确诊标准依据中国高血压防治指南（2010年修订版）[10]，排除继发性高血压患者和免疫系统疾病患者。

1.2 指标测定的材料、试剂及仪器

试剂：TRIzol LS Reagent（Ambion公司，美国）、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo 公司，美国）、Maxima SYBR Green qPCR Master Mix（Thermo公司，美国）、 RNase-free water（北京天根生化技术公司，中国）、引物由上海生工生物工程有限公司代合成、其它均为国产试剂。仪器：ND-1000型微量紫外分光光度计（Thermo公司，美国）、5430R低温台式冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）、BG-power5000型稳压稳流电泳仪（北京百晶生物公司，中国）、实时定量聚合酶链式反应（PCR）仪（Bio-rad公司，美国）、普通 PCR 仪(Applied Biosystems公司，美国)。

1.3 研究方法

1.3.1 RNA的提取、反转录及定量分析

RNA的提取按照TRIzol®LS Reagent试剂说明书进行，所提取RNA通过微量分光光度计测定浓度。并用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kits说明书进行反转录，使用茎环式引物作为反转录引物。按照Maxima SYBR Green qPCR Master Mix说明书进行实时定量聚合酶链式反应（PCR）测定miRNA表达量，用通用引物U-R和miRNA特异引物分别作为上下游引物，引物退火温度均为60℃，其他参照说明书，采用2-ΔΔCt法进行数据表达量分析。

1.3.2 引物

以U6作为管家基因，miRbase中提供的miRNA成熟序列设计茎环式反转录引物和实时定量扩增引物。引物序列如表1。

表1 引物序列

1.4 统计学分析方法

用SPSS19.0统计软件对试验数据进行统计分析。所有数据用均值±标准差表示。选用分析方法有单因素方差分析（ANOVA LSD），双变量相关分析及多因素Logistic回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床基本情况（表2）

表2 两组患者临床基本情况及相关指标的检测结果

表2 两组患者临床基本情况及相关指标的检测结果

注： miRNA：微小RNA。1 mmHg=0.133 kPa

结果显示，年龄、性别和体重指数，在原发性高血压组和正常对照组中差异无统计学意义（P＞0.05）；而原发性高血压组的收缩压和舒张压均高于正常对照组（P均＜0.05）。

2.2 miRNA表达方面（表2）

原发性高血压组中Let-7e、miRNA-605的表达量均高于正常对照组（P＜0.05）；而原发性高血压组中miRNA-206、miRNA-1236的表达量均低于正常对照组（P＜0.05），差异均有统计学意义。

2.3 相关性分析（表3）

结果可见，Let-7e的表达量与收缩压呈显著正相关（r=0.562，P＜0.05）；miRNA-206表达量与收缩压呈显著负相关（r=-0.582，P＜0.05），与舒张压呈显著正相关（r=0.507，P＜0.05）；miRNA-605的表达量与收缩压呈显著正相关（r=0.625，P＜0.05）；miRNA-1236的表达量与舒张压呈显著负相关（r=-0.598，P＜0.05），与体重指数呈显著正相关（r=0.690，P＜0.05）。

2.4 多因素Logistic回归分析（表4）

结果显示，年龄和性别不是原发性高血压的的危险因素（P=0.9842），体重指数的升高，显著增加患原发性高血压的危险（P＜0.01），Let-7e和miRNA-605的表达量的升高，显著增加患原发性高血压的危险（P＜0.05和P＜0.01），而miRNA-206和miRNA-1236的表达量的降低，也显著增加原发性高血压患病的风险（P＜0.01和P＜0.01）。

表3 miRNAs表达量与原发性高血压相关性分析

表4 多因素Logistic回归分析结果

3 讨论

高血压患病率逐年升高[10]，在我国有70%的脑卒中和50%的心肌梗死与高血压有关[11]，高血压已成为我国重大的公共卫生问题。研究发现原发性高血压的发病是与多种因素有关[12]。miRNA 是一类由18～25 nt核苷酸组成的非编码单链保守的小分子RNA，其表达具有组织特异性等特点，在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用[13]。近年来，研究发现miRNA与高血压的发病机制有关[14]，目前主要发现，miR-9、miR-21、miR-18b等可能参与高血压的发病机制[15-18]。研究发 现，Let-7e[14]、miRNA-206[19]、miRNA-605[20]及miRNA-1236[21]可能通过抑制平滑肌增殖，促进血管再生，抗动脉粥样硬化，抗血栓等作用参与原发性高血压的发病，但是其结果仍然存在一定争议，还有待深入研究。

Let-7e被发现与小鼠的心脏发育有关，其靶标叉头框蛋白1（FOXP1）、T盒转录因子5（TBX5）、心脏和神经嵴衍生物表达蛋白1（HAND1）、蛋白激酶2（AKT2）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活1A（PPARGC1A）等也参与血管的形成[22]；miRNA-206及其靶标神经源同源蛋白3（Notch3）、低氧诱导因子1 (HIF-1a)被发现参与平滑肌细胞增殖与分化[23，24]；miRNA-605及其靶标蛋氨酸合成酶还原酶（MTRR）、SERTA 结构域蛋白 4（SERTAD4）、共济失调毛细血管扩张症核因子（NPAT）、FAM3A等参与P53通路，与癌症及细胞凋亡有关[25]；miRNA-1236及其靶标VEGFR、含7螺旋结构域蛋白（CCDC7）、RAS通路相关蛋白13（RAB13）、细胞色素P450 4V2（CYP4V2）等与VEGF通路有关[26]。本研究通过对Let-7e，miRNA-206，miRNA-605及miRNA-1236及其生物学功能进一步鉴定，确认Let-7e、miRNA-206、miRNA-605及 miRNA-1236与原发性高血压的发病具有相关性。

尿液、外周血等体液中含有循环miRNA，其可以作为诊治疾病的临床标志物[27，28]。由于循环 miRNA具有易获取、易研究的特点，逐渐成为疾病标志物研究及发病机制的热点，具有一定临床意义。本研究发现Let-7e、miRNA-206、miRNA-605 及miRNA-1236可以作为原发性高血压诊断的候选标志物，尽管临床的应用还需要更多的样本做验证，而且相比于目前的诊断技术，尽管不是非常方便，但是或许可以用于特殊类型高血压或者继发性高血压的区别和鉴定。另外Let-7e、miRNA-206、miRNA-605及 miRNA-1236可以作为原发性高血压治疗的候选靶点，通过抑制或增强内源miRNA及相关基因的表达，或者补充外源的miRNA，使其miRNA的表达向期望的方向发展，进而有助于原发性高血压疾病的治疗。

高血压已经严重危害人类健康的疾病，尽管目前的防控措施已经取得显著效果，但很难治愈。本研究初步证明Let-7e、miRNA-206、miRNA-605及miRNA-1236的表达量与原发性高血压的发病有很大的关系，其具体调控机制还有待后续细胞以及动物实验的进一步验证。

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