太子参均一多糖HPLC-FLD检测方法的建立

栗 园 杨 斌 阚永军 胡 娟. 庞文生*

1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建省中医药研究院，福建 福州 350003

太子参为石竹科植物孩儿参Pseudostellariaheterophylla(Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.的干燥块根，具有益气健脾、生津润肺的功效[1]，其多糖有显著的降血糖作用，且能降低血脂水平，改善脂质代谢紊乱[2]。课题组前期利用水提醇沉法得到太子参粗多糖，采用DEAE-纤维素、葡聚糖凝胶色谱柱对太子参粗多糖进行分离纯化得到均一多糖[3-6]。为了进一步考察均一多糖的活性，建立灵敏、特异性强的检测方法，是监测均一多糖细胞体外/动物体内吸收、代谢特征的关键。

目前检测多糖的方法有分光光度法、柱前衍生-高效液相色谱法、酶联免疫法、电化学法。传统苯酚硫酸分光光度检测法粗糙、灵敏度低；酶分析法或电化学法虽然检测灵敏度高，但受到特异性及样品中污染物干扰的限制；色谱法能够准确、灵敏地对多糖进行定性定量的分析，因此在多糖的分析中占有非常重要的地位；而柱前衍生-高效液相色谱法，是将样品水解后测定单糖组成，无法考察多糖分子的整体行为[7-8]。

对糖类物质而言，其化学结构中不含生色团，不产生紫外光吸收；多数不产生荧光，无法实现直接进行紫外或荧光检测。因此，笔者对太子参均一多糖进行荧光标记，建立一种太子参荧光均一多糖的HPLC-FLD检测方法，以期为太子参多糖在细胞或体内吸收和活性研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 MOKULYOD-230型冷冻干燥器；3001多功能酶标仪(Thermo Fisher 公司)；HL-2D定时数显恒流泵；DBS-100自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂有限公司)；AE240S分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；Waters e2695液相色谱仪、Waters 2475荧光检测器(Waters 公司)；HiTrapTM Desalying分离柱(5 mL，5×5 mL)；Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 Lμm)色谱柱。1.2 材料 太子参样品于2016年7月购于福建柘参种业有限公司，经福建省中医药研究院阚永军实习研究员鉴定为石竹科孩儿参的干燥块根；葡聚糖标准品购于福州天美化工仪器设备有限公司(Pharmacia17-0320-01)；异硫氰酸荧光素(FITC,批号：SLBH5922V，Sigma 公司)；Celluose DE-52(批号：1030A024，Whatman 公司)；Sephacryl S-300HR(批号：20140117，GE 公司)；氰基硼氢化钠(批号：1605027，aladdin 公司)；甲醇(批号：20080418)、DMSO(批号：20130711)、乙酸(批号：20160425)、硝酸钠(批号：20151225)等购自国药化工；无水乙醇(批号：16010902，西陇化工有限公司)。

2 方法与结果

2.1 太子参均一多糖的荧光标记 取一定量太子参均一多糖，溶于DMSO，依次加入100μL氰基硼氢化钠溶液，100μL酪胺溶液，50μL冰醋酸，补充DMSO到2 mL，多糖∶氰基硼氢化钠∶酪胺的质量比为2∶1∶2，60℃反应4h；离心，上清液过HiTrapTM Desalying柱，用水洗脱，酶标仪280nm检测，收集第一个峰，冻干得多糖-Tyr。

取一定量的多糖-Tyr，加入pH=8.5的0.5 mol/L NaHCO31.5 mL，加入过量FITC，避光反应过夜；反应物中加入无水乙醇至终浓度为80%，离心，沉淀加水复溶，乙醇再沉淀，重复3次，得多糖-Tyr-FITC；HiTrapTM Desalying柱纯化，酶标仪490～518 nm检测，收集第一个峰，冻干即得。

2.2 荧光多糖的HPLC-FLD检测条件考察2.2.1 检测波长的确立 准确称取一定量的FITC，用30%乙腈溶解，酶标仪分别固定激发波长和发射波长来确立最佳检测波长，结果见表1。当固定激发波长时，发射波长在518 nm时有最大吸光度；固定发射波长时，激发波长在490 nm时有最大吸光度。因此，确立荧光检测激发波长(λx)为490 nm、发射波长(λm)为518 nm。

表1 最佳检测波长选择结果

2.2.2 样品溶剂的选择 采用不同溶剂溶解FITC，相同色谱条件下分析，结果如图1所示。采用水、0.01 mol/L磷酸二氢钾、25%甲醇作为溶剂，均不能检出FITC色谱峰；以30%乙腈作为溶剂，FITC可得单一对称峰。因此确定30%乙腈作为样品溶剂。

2.2.3 流动相的选择 分别为甲醇-水(25∶75)、甲醇-氨水(60∶40)、乙腈-0.01mol/L磷酸二氢钾(30∶70)作为流动相，其余色谱条件相同下检测，结果如图2所示。以甲醇-水(25∶75)、甲醇-氨水(60∶40)为流动相时，FITC均不能被检出；以乙腈-0.01mol/L磷酸二氢钾(30∶70)为流动相时，FITC可得单一对称峰。因此，确定乙腈-0.01mol/L磷酸二氢钾(30∶70)为流动相。

2.2.4 色谱柱的选择 以色谱柱为考察因素，考察Waters Ultrahydrogel TM 500 (7.8×300 mm)、大连依利特Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，在相同色谱条件下分析，结果如图3所示。用Waters Ultrahydrogel TM 500(7.8×300mm)色谱柱时，FITC不能出峰；用大连依利特Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱时，FITC可得单一对称峰。因此，确定大连依利特Hypersil BDS C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)为本实验的色谱柱。

综上，本研究所建立方法的最佳色谱条件为：Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；乙腈-0.01 mol/L磷酸二氢钾(30∶70)流动相；流速0.5 mL/min；柱温35℃；进样量20 μL；检测激发波长为490 nm，发射波长为518 nm；样品溶剂为30%的乙腈。

2.3 荧光均一多糖的HPLC-FLD检测2.3.1 标准曲线的建立 精密称取分子量为40000 Da荧光葡聚糖标准品0.25、0.5、1、2、4 mg，30%的乙腈定容至10 mL，得浓度为25、50、100、200、400 μg/mL的标准溶液，按“2.2.4项”下的色谱条件检测，以浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积(伏·秒)为纵坐标，得线性回归方程Y=0.073x+ 0.310，相关系数r=0.9989。

2.3.2 样品分析 准确称取300 μg太子参荧光均一多糖，30%的乙腈定容至1 mL，浓度为300 μg/mL，以同样的方法配制FITC溶液，按“2.2.4项”下的色谱条件检测。结果如图4所示。

结果表明，在该条件下未标记均一多糖未检测到色谱峰，FITC色谱峰保留时间为36.58 min，荧光均一多糖保留时间为4.25 min，峰面积为13.75伏·秒，代入回归方程，得出太子参荧光均一多糖以荧光葡聚糖(分子量40000 Da)计浓度为184.1 μg/mL。

3 讨论

3.1 溶液选择 对太子参荧光均一多糖的HPLC-FLD的检测条件考察过程中，发现荧光多糖在有乙腈存在的体系中容易被检测到，因此样品溶剂和流动相中都含有乙腈；多糖在乙腈中的溶解度与分子量成反比，所以本实验样品溶剂和流动相中均含有30%的乙腈。

3.2 对照品选择 本实验所用太子参荧光均一多糖的分子量在50000 Da左右，由于没有太子参荧光多糖的对照品，因此选择结构相似、分子量相近40000Da的荧光葡聚糖标准品作为对照品，所以本实验是以荧光葡聚糖表示太子参荧光均一多糖的测定结果。

3.3 检测方法建立 对糖类物质而言，其化学结构中不含生色团，不产生紫外光吸收；多数不产生荧光，无法实现直接紫外或荧光检测。本文采用FITC对太子参均一多糖进行荧光标记后，实现高效液相色谱荧光检测器检测；所建立的检测方法检测限低、受杂质干扰较小，可为今后研究太子参多糖在体内外的吸收特征、药效分子机制等提供技术支撑。

综上，笔者将一种太子参均一多糖成功地进行了荧光标记。以490 nm为激发波长、发射波长518 nm，大连依利特Hypersil BDS C18(4.6 mm×250 mm/5 μm)色谱柱，30%的乙腈为样品溶剂，乙腈-0.01 mol/L磷酸二氢钾(30∶70)为流动相，建立太子参荧光均一多糖的HPLC-FLD检测方法。该方法准确、有效，可为太子参多糖在体内外吸收特征和活性研究奠定基础。

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