辛伐他汀对大鼠冠状动脉微栓塞后心肌微小血管的影响及潜在机制

马丽，韩红彦，戴文琴

冠状动脉微栓塞（CME）在临床较常见，严重影响患者的心功能及预后。CME引起心肌微循环灌注障碍，因而恢复心肌组织的血流灌注成为CME治疗的切入点[1]。动物试验发现[2]，他汀类药物具有明显改善心肌微循环和促进血管再生的作用，其机制为减少甲烃戊酸通路中间产物异戊烯类生物合成，进而使丝氨酸-苏氨酸磷酸化而活化，增加内皮型一氧化氮合酶（NOs）的稳定性和活性，提高心肌一氧化氮（NO）水平[3,4]。本研究分析了辛伐他汀干预对大鼠CME后心肌微小血管的影响及可能机制，旨在为CME的临床治疗提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组 选取SPF级雄性SD大鼠60只，体质量230～260 g，由同济医学院实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（鄂）2004-0007。所有动物适应性饲养1周，自由摄食全价颗粒饲料，温度控制在18℃～24℃。将其随机分成4组，各15只：对照组（A组）、假手术组（B组）、冠状动脉微栓塞组（C组）、辛伐他汀干预组（D组）。

1.2 实验试剂和仪器 辛伐他汀（山东鲁抗制药有限公司），高敏C反应蛋白（hs-CRP）、内皮素-1（ET-1）等检测试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。多功能生理记录仪及TKR-200C动物呼吸机（成都泰盟仪器厂）、5-MHZ多平面经食道超声探头及V超声心动图仪（美国GE公司）、Image pro 4.0显微镜联合计算机纤维分析系统（日本尼康公司）。

1.3 冠状动脉微栓塞模型制作方法 自心尖部注入大鼠自体血栓微粒造成心肌微小血管栓塞建立冠状动脉微栓塞模型。每只大鼠尾静脉取血2 ml凝固形成血栓，恒温箱（37℃）过夜烘干，研磨器研磨后过滤使之成均匀颗粒，每只动物称8 mg血栓颗粒备用[5]。次日大鼠腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，取仰卧位，气管插管，呼吸机通气辅助。在大鼠第2肋间水平横切，剪断胸骨，切开心包后充分暴露主动脉根部。取备用的血栓颗粒于生理盐水0.5 ml混匀，用1 ml的注射器吸取0.5 ml血栓悬浮液注入心尖，同时钳夹升主动脉，10 s后松开，压迫穿刺口止血成功后关胸复苏。术后每天肌肉注射青霉素（40万U/只），持续3 d。

1.4 干预方法 D组：制备CME模型后，辛伐他汀溶于5 ml生理盐水，灌胃给药（2 mg/kg），1/d；C组：制备CME模型后，给予5 ml生理盐水灌胃，1/d；B组：手术过程自心尖注入生理盐水替代血栓微粒，给予5 ml生理盐水灌胃，1/d；A组：为健康大鼠，给予5 ml生理盐水灌胃，1/d。所有大鼠均于持续干预28 d后处死。

1.5 指标测定方法

1.5.1 微小血管免疫组化染色 处死大鼠，分离心脏，游离肉眼可见的冠状动脉栓塞，微小血管密度及数量变化按照文献[6]的评判标准，加入CD31抗体进行免疫组化染色，计算动脉栓塞内着色的微小血管。管腔并非确认微血管的唯一标准，凡呈现棕黄色单个或成群无管腔的染色细胞均作为1个微血管计数，其中血管直径＞8倍红细胞直径或管腔直径≥50 μm及肌层较厚的血管不计数。计数方法为：先在低倍视野下观察整张切片的血管分布情况，然后选取栓塞灶内5个微血管最丰富的区域，在400倍视野下（每个视野0.37 mm2）进行计数，取其平均值并观察各组大鼠微小血管密度及数量变化。

1.5.2 hs-CRP、NO和ET-1水平检测 将大鼠心脏置于4℃冰浴下进行匀浆，3000转/min，离心10 min，取上清，采用Au2700全自动生化分析仪（日本Olympus）检测hs-CRP，采用放射免疫法检测NO，采用硝酸还原酶法检测心脏匀浆中的ET-1。

1.6 统计学方法 统计分析采用SPSS 19.0软件，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LDS-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠微小血管密度变化 与A组和B组比较，C组和D组微小血管密度明显下降，差异有统计学意义（P均＜0.05）。同时，与C组比较，D组的血管密度增加，差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。免疫组化染色结果，A组和B组的棕黄色单个或成群无管腔的染色细胞较多且密集，C组和D组的棕黄色单个或成群无管腔的染色细胞较少且稀疏，与C组比，D组的着色细胞明显增多（图1）。

2.2 各组大鼠hs-CRP、NO和ET-1水平比较 与A组和B组比较，C组NO和ET-1水平明显降低，hs-CRP水平明显增加，差异有统计学意义（P均＜0.05）。与C组比较，D组NO和ET-1水平明显增加，差异有统计学意义（P均＜0.05）（表2）。

表1 各组大鼠微小血管密度比较

图1 各组大鼠心脏微小血管免疫组化染色（×400）

表2 各组大鼠hs-CRP、NO和ET-1水平比较

3 讨论

对急性心肌梗死的研究发现冠状动脉造影TIMI 3级的患者，35%左右心肌组织的血液供应尚未完全恢复[7]。在PCI过程中，CME引发的心肌梗死可达35%且经血栓回收装置发现绝大部分患者均存在微小栓子[8]。CME可造成心肌组织灌注障碍，在急性期主要表现为低复流或无复流现象、微小心肌梗死或心肌梗死、心肌标志物升高、心律失常及血流动力学障碍等；慢性期还可发生心功能进行性降低及心肌重塑，CME发生后慢性过程仍可出现心功能进行性或持续性恶化，严重时可引发患者猝死[9,10]。

他汀类药物是现阶段强效降脂药物，临床已广泛用于冠心病的一级、二级预防和高胆固醇血症的治疗。他汀类药物不仅具有降脂作用，还有其他作用，很可能是独立于降脂作用以外的对心肌功能和结构的保护作用[11]。他汀类药物的作用机制主要有以下几点[12,13]：①抗氧化作用可发挥心肌保护作用；②心肌纤维化和肥厚是发生充血性心力衰竭和冠心病的危险因素，中枢及外周血管紧张素Ⅱ水平升高。他汀类药物可抑制血管紧张素Ⅱ介导的心肌纤维化和心肌肥厚；③他汀类药物可促进血管内皮细胞释放NO，保护缺血再灌注心肌。

本研究结果发现，与A组和B组比较，C组和D组微小血管密度明显下降，同时，与C组比较，D组的血管密度增加。提示经辛伐他汀干预后，可减少CME对心肌微小血管的破坏。

NO和ET-1均是调节心血管舒张和收缩功能的重要细胞因子，在动脉粥样硬化斑块的发生、发展过程中作用显著。正常生理条件下，血管内皮细胞可通过调整NO和ET-1的浓度保证血管正常的舒缩功能，避免斑块的形成。病理条件下，血管内皮受动脉粥样硬化的影响分泌的ET-1增加，但NO的合成下降[14]。与A组和B组比较，C组NO和ET-1水平明显降低，hs-CRP水平明显增加；与C组比较，D组NO和ET-1水平明显增加。上述结果提示辛伐他汀主要是通过影响NO信号通路发挥血管新生的作用。

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