可口革囊星虫室内自然产卵受精的研究

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(1.福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门361013； 2.宁德市蕉城区漳湾镇水产技术推广站，福建 宁德352100)

可口革囊星虫(Phascolosomaesculenta)，隶属于星虫动物门、革囊星虫纲、革囊星虫科，为我国的特有种，也是我国星虫中产量较大的种类[1]。可口革囊星虫主要生长在河口潮间带的中、高潮海区，是经济价值较高的养殖品种。宁德地区是福建省可口革囊星虫主要产区，其滩涂养殖已成为当地的特色水产养殖产业，但因受天然苗种的限制，养殖规模一直未能扩大。目前，可口革囊星虫苗种仍依靠海区人工采集，收集小规格个体作为苗种提供给养殖户。近年受沿海滩涂开发利用以及过度采挖的影响，可口革囊星虫资源量急速下降，人工采挖区也越来越分散，导致苗种成本不断上涨。因此，该苗种大规模人工繁育技术的研究已逐渐引起重视。

获得可口革囊星虫受精卵方法有3种：阴干刺激、低温刺激和自然产卵。目前，这3种方法在可口革囊星虫和裸体方格星虫生产试验中，均有成功催产的报道。如陈慧等[2]、兰国宝等[3]分别在可口革囊星虫和裸体方格星虫的育苗试验中，采用阴干刺激方法进行人工催产，星虫产卵并受精成功。吴洪喜等[4]选择在砂滤海水暂养2 ～ 3 h可口革囊星虫亲体，然后沥水置于恒温箱中降温(低于自然水温8 ～ 10℃)刺激30 ～ 40 h，也取得较好的产卵、受精效果。而曾梦清等[5]、邹杰等[6]采集星虫亲体，在铺设泥沙质的水泥池中进行培育试验，也都获得产卵及受精。但从以上研究的结果来看，均存在产卵时间短、产后亲虫死亡率高及亲体培育后期产卵量少等生产性问题。因此，本试验利用自然海区采集的成熟亲体，在室内人工培育条件下研究可口革囊星虫繁殖期亲体的怀卵量、产卵量、卵质及产卵规律，旨在总结一套人工培育催产的模式，为后期人工苗种的大规模培育提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 亲体来源

可口革囊星虫亲体采自宁德市蕉城区三都澳海区。挑选健康、形态正常、体表无破损的亲虫约60 kg(平均个体体重4.61 g)，于2015年6月10日移入室内产卵池进行培育。由于性成熟个体的性别通过外观较难以确定，因此在繁殖季节，往往通过体腔是否有卵子来判断雌雄个体。在繁殖期取其体腔液，并用海水稀释，取1～2滴于载玻片后，在光学显微镜下观测并统计亲体的雌雄比例。

1.2 养殖设施

试验地点为福建省海水鱼类苗种繁育科研中试基地，室内水泥产卵池3个(3.5 m×3.5 m×1.5 m)，底泥取自龙海浮宫附近海区的中高潮地，为泥沙质，经曝晒、除杂后铺于池底，池边铺设厚度约为15 cm，中部约10 cm，形成池边高、中间低的锅底形，并在池中留一条小沟，方便排干池水。试验海水为经沉淀的蓄水池水，经沙滤后使用。

1.3 饵料

选用室外泥质池塘，施适量有机肥，培养底栖硅藻为亲体饵料。不定期刮取池塘表层富含有机物和底栖硅藻的泥沙，排干水后均匀泼洒在亲体培育池的泥面上。

1.4 方法

培育时间为2015年6月10日—2015年9月30日。培育期间环境因子均为自然状况，亲体培育水温26～32℃，盐度25～26，pH 7.6～8.5。产卵池每日上午08∶00排干池水，干露10～12 h，至傍晚后加满池水。排水前要先检查是否产卵及统计产卵数量，另取100粒卵置于200 mL烧杯中，测定其受精率。当日产卵数量大于10×104粒时，用200目的筛绢网收集后进行培育观察。

定期检查10～15条亲虫，观测其体腔内胃肠饱满度、卵细胞发育状况并估算生殖力，由于可口革囊星虫卵细胞数量较大，称重后逐一解剖，体腔液放入烧杯中，加沙滤海水至100 mL，借助解剖镜在计数板上计数，用体积法计算雌性个体体腔的卵细胞数量，并计算其相对怀卵量，其公式：相对怀卵量(粒/g)=个体怀卵总数(粒)/个体体重(g)。

2 结果

2.1 体重及雌雄比例

可口革囊星虫雌雄以体腔液含有卵细胞或精细胞来区别，随机抽样100条亲体，测得雌雄个体数分别为48条和52条，经卡方检验结果表明，显示的检验显著性水平为0.689(P>0.05)，可认为可口革囊星虫自然群体雌雄比例是均匀的。雌性个体体重为3.03～7.84 g，平均体重为4.74 g；雄性个体体重为2.98～7.25 g，雌雄个体平均体重约为4.61 g。

2.2 体腔卵细胞数量

在繁殖盛期(7—9月)，可口革囊星虫体腔卵子大小比较均匀，大部分卵子为大型卵子，卵略呈椭圆形，长径约142 ～149 μm，短径约121 ～132 μm。2015年7月10日，取样并统计50条雌性可口革囊亲体的怀卵量(表1)。从表1可以看出，卵细胞的数量与个体大小直接相关，怀卵量与个体体重的关系可描述为：y=-0.958 6x2+16.8x-19.827，相对怀卵量与体重的关系式为：y = -0.149 2x2+ 1.450 3x + 4.512 4(图1)。

表1 可口革囊星虫个体体重与怀卵量关系

编号Number体重/gWeight怀卵量/104粒Fecundity编号Number体重/gWeight怀卵量/104粒Fecundity12．8421．32264．5936．6323．7225．91278．0545．2033．4723．54283．9132．5244．0334．44295．4736．8653．2528．60303．5329．6064．8142．85314．0933．3577．5960．10323．9435．0088．1853．20333．4728．7595．3145．68346．3446．80107．8159．91353．5023．80116．3155．53363．9128．76127．1256．80375．4740．50134．8142．17383．5326．58145．5646．86394．0932．80155．8453．34403．9437．95164．0635．05414．1932．50173．6626．80422．8819．77185．0041．50434．4732．43

续表1

分析结果显示，繁殖期间亲体的怀卵量与个体体重成正比，怀卵量随个体体重增加而增加，当体重在2.84～8.18 g之间时，绝对怀卵量为19.77×104～60.10×104粒。相对怀卵量则有所不同，在个体体重小于5.0 g时，相对怀卵量与个体的体重成正比，并随个体体重增加而增加；当亲体体重大于5.0 g时，相对怀卵量与个体的体重则成反比，且随个体体重增加而逐渐下降。以全部测定的星虫计，平均相对怀卵量约为7.66×104粒/g。由试验结果可知，挑选可口革囊星虫亲体时，最佳体重为3.0～5.0 g，其生殖力也达到最佳水平。当然，不同海区的可口革囊星虫群体是否有所差别，还有待进一步研究。

2.3 产卵

2015年6月10日从海区收集的可口革囊星虫亲体置于池中培育，至6月30日开始出现产卵现象，表明可口革囊星虫已进入产卵期。亲体的产卵行为大多数发生于午后4点，产卵断断续续，先产少量的卵，傍晚后产卵较为集中，一直持续到夜间凌晨1点基本结束，产卵行为一般持续6～8 h。亲虫的产卵自6月30日至9月22日共持续85 d(表2)，总产卵量为1 673.0×104粒，平均受精率为57.4%，其中最高为85.0%，最低为0%。随后，7月份总产卵量为749.5×104粒，占全部产卵数量的44.8%；日最高产卵量为7月19日，产卵量为350.0×104粒，7月2日次之，产卵量为150.0×104粒。从产卵阶段来看，有明显的两个高峰期，分别为7月2日—4日和7月18日—21日，两个高峰期间隔约15 d。在产卵高峰期，也仅有一天产卵产量较大，其余天数产卵量相对较小，之后停止产卵数天，呈现明显的间歇性产卵。日产卵量大于10×104粒的天数有9 d，0～10×104粒的天数有10 d，不产卵的天数有12 d。受精率变化范围为0%～85%，受精率和产卵量有一定的关系，在日产卵量高时，受精率一般也相对较高，如7月2日、7月19日受精率分别为82%、85%，而产卵量少的日期，受精率一般也不高(图2)。

表2 可口革囊星虫产卵量和受精率

续表2

8月份亲体的总产卵量为699.5×104粒，占全部产卵数量的41.8%；日最高产卵量在8月2日，达210.0×104粒，8月28日次之，产卵量为130.0×104粒，再次为8月16日，产卵量为95.0×104粒。从产卵的阶段来看，有明显的3个高峰期，分别为8月1日—3日、8月15日—17和8月27日—29日，间隔分别约15 d。产卵规律与7月份的类似，在产卵高峰期，也仅有一天产卵量较大，其余时间产卵量相对较小，之后停止产卵数天，呈现明显的间歇性产卵。日产卵量大于10×104粒的天数有12 d，0～10×104粒的有6 d，不产卵天数最多，为13 d。受精率变化范围为0%～75%，与7月份情况相似，受精率和产卵量有一定的关系，日产卵量高时，受精率一般也相对较高，如在8月2日、8月28日受精率分别为75%、72%，而在产卵量少的日期，受精率一般也不高(图3)。

9月份总产卵量为221.0×10×104粒，占全部产卵数量的13.21%；日最高产卵量的时间为9月5日，产卵量50.0×104粒，9月17日次之，产卵量为30.0×104粒。从产卵的阶段来看，有明显的两个产卵高峰期，分别为9月5日—8日、9月12日—20日，两个高峰期间隔约7 d。与7、8月份比较，产卵量明显减少，产卵数量不集中，呈无规律性。9月份受精率为0%～60%，明显低于7、8月份(图4)。

从整个产卵过程来看，亲体产卵时间主要集中在7—8月，产卵量占86.79%，6月份产卵极少，9月份由于闽南地区台风的影响，气温变化较大，水温往往会发生下降现象，导致星虫产卵量也明显下降。从卵的质量看，7—8月的受精卵质量优于9月，培育效果明显较好。

3 讨论

3.1 生殖方式及雌雄比例

可口革囊星虫为雌雄异体，体外无明显的性征，体内无肉眼可见的生殖腺结构，生殖方式属于典型分批排放类型*吴洪喜，陈琛，应雪萍，等.可口革囊星虫的繁殖生物学与生活史[C]//2007年中国水产学会学术年会暨水产微生态调控技术论坛论文摘要汇编.北京：中国水产学会，2007：106.。可口革囊星虫成熟的体腔卵子分一批或多批排完，亲体产卵后并不会死去，而是在翌年再次生育产卵。由于可口革囊星虫没有第二性征，很难在外形上区别雌雄，但在生殖季节，可通过体色大致识别。如陈慧等[7]在可口革囊星虫生殖周期的观察过程中，发现在繁殖季节，雄性星虫肾管聚集大量待排放的精子而变得相当膨大，外观呈乳白色，可伸至体腔中后部，其直径增大2～3倍，长度增长3～4倍；雌性星虫肾管因受精卵母细胞膨大加粗而呈暗绿色，可伸至体腔中后部，其直径增大3～4倍，长度增长4～5倍。兰国宝等[8]在方格星虫繁殖生物学研究中，也观察到同样现象，即在繁殖季节，成熟的个体可以通过半透明的体壁观察肾管的颜色而加以区别。雄性个体肾管呈乳白色条状，雌性个体肾管呈暗红色条状。

性成熟个体的性别比例在大多数月份很难确定。陈慧等[7]通过解剖取体腔液，在显微镜下观察生殖细胞形态来区分雌雄。但在非繁殖季节，往往太多个体无法判断雌雄，就是在繁殖季节，也有不少的个体因未达到性成熟而无法判别雌雄。兰国宝等[8]在1999—2000年星虫繁殖期季节中，随机取样检查1 653条裸体方格星虫，无法确定性别达175条，雌雄比例近似于1∶1。本次试验挑选了体重大多在3 g以上的可口革囊星虫个体100条，检测发现雌雄性条数相差不大，雌雄个体数分别为48条和52条，接近1∶1。虽然个别星虫可以依靠体色判断雌雄，但大多数还是要通过观察体腔生殖细胞来进行区分，也说明星虫肾管收集卵子或精子的时间很短，可以通过体色来判断雌雄的时间有限。

3.2 生殖力

生殖力在一定程度上反映了动物的繁殖方式。可口革囊星虫卵子直接排出体外，体外受精，其产卵量可达数万至十几万粒。本试验观察结果发现星虫的生殖力随个体的大小而异，较大的成体星虫比小个体的怀卵量多，但年龄大的个体，怀卵量反而有所下降。这说明亲体的怀卵量与其体重成正比，随个体体重增加而增加，当体重在2.84～8.18 g之间时，绝对怀卵量为19.77×104～60.10×104粒。然而，相对怀卵量则有所不同，在体重小于5 g时，相对怀卵量与个体的体重成正比，随个体体重增加而增加；在体重大于5 g时，两者则成反比，即随个体体重增加而逐渐下降。本试验中测定的亲体平均相对怀卵量约为7.66×104粒/g。怀卵量与个体体重的线性关系：y=-0.958 6x2+16.8x-19.827。相对怀卵量与体重的线性关系：y = -0.149 2x2+ 1.450 3x + 4.512 4。因此，开展可口革囊星虫大规模育苗应挑选的亲体体重在3.0～5.0 g为好，其生殖力可达最佳水平。当然，不同海区的可口革囊星虫群体是否有所差别，还有待进一步研究。

本试验中，可口革囊星虫平均相对怀卵量达7.66×104粒/g，亲体的产卵自6月30日至9月22日相对产卵量为0.027×104粒/g，总产卵量仅约占总怀卵量的0.71%。与裸体方格星虫的怀卵量比较，邹杰等[9]在2009年观察到繁殖季节个体质量为7.33 g的雌性个体体腔液约2.8 mL，卵径大于70 μm的卵细胞约2.5×104粒，而体质量为23.2 g的雌性个体体腔液可达13.8 mL，卵径大于70 μm卵细胞数量可达17.7×104粒，其相对怀卵量为0.34×104～0.76×104粒/g；彭慧婧等[10]在对裸体方格星虫的催产试验中，挑选平均体重21.3 g的亲体进行催产，6—8月的雌性裸体方格星虫平均产卵分别为3.20×104粒、4.43×104粒和3.46×104粒，累计产卵达11.1×104粒，产卵量约占总怀卵量的60%。由此可见，不同种类的星虫产卵情况存在较大的差异。

3.3 体腔卵细胞的变化

本试验观察发现，7—10月可口革囊星虫体腔内的小卵组消失，体腔卵细胞卵径分布较为一致，绝大多数为大卵型，呈现椭圆形。至11月以后，大型卵细胞开始退化，小型的卵细胞出现频率增加。直到翌年2—3月，中型卵细胞才逐渐增多，这类同于刘懂等[11]发现在7—9月大部分的体腔卵细胞卵径均在110 μm以上，其中130～150 μm的卵细胞约占2/3，11月后大卵径细胞开始退化。但陈慧等[7]观察到7—9月体腔为50～80 μm的个体的卵细胞占4.36%～12.07%，这可能与本试验取样的个体大小差别有关。

对于体腔卵子的变化，陈慧等[7]根据可口革囊星虫卵母细胞发育过程的形态特征和存在形式，将其卵母细胞发育分为五个时期，分别为细胞增殖期、细胞质生长期、胶质膜形成期、成熟前期和成熟期。不同星虫种类体腔卵细胞存在形式有所不同。Gonse等[12]报道法国Roscoff地区的G.vulgaris产卵期为6—9月，小型体腔卵细胞全年存在，并在产卵期以后出现生长停滞。郭学武等[13]发现裸体方格星虫于5月进入繁殖季节，6—8月为繁殖盛期，体腔细胞不断成熟并陆续产出；5—9月份体腔成熟卵细胞的数量比为173∶165∶96∶65∶9，成熟卵细胞所占的比例逐月减少；至7月，体腔有大量直径小于40 μm的卵细胞，8月体腔内50～155 μm的卵细胞数量较多，并不断地成熟并产出。与上述有所不同的是，可口革囊星虫产卵季节为7—9月，期间的体腔细胞已发育成大型卵细胞，小型的卵细胞几乎不存在；10月下旬，大型卵细胞数迅速减少(图5)。可口革囊星虫体腔卵子的形态为圆形或椭圆形，直径在50 μm以下大多为圆形，50～100 μm时，大多为卵圆形或椭圆形，随着卵子的发育，卵子的长短轴比例发生变化，卵子体积逐渐增加，进入到肾管的卵细胞，体型变为近圆形。

注：a.7月份体腔卵细胞；b.8月份体腔卵细胞；c.9月份体腔卵细胞；d.10月份体腔卵细胞。

Notes：a was coelomic oocyte in July；b was coelomic oocyte in August；c was coelomic oocyte in September；d was coelomic oocyte in October.

3.4 亲体产卵次数和产卵量

可口革囊星虫的产卵方式为分批成熟和多次产出类型。在繁殖季节的7—8月，从海区收集的成熟可口革囊星虫，通过阴干刺激方法，可获得受精卵。对于星虫亲体的培育模式，作者在裸体方格星虫的亲体培育及催产过程中取得比较好的经验，在繁殖季节前2个月，即每年的4月，从海区收集健康的亲体，经室内人工培育后获得大量的受精卵。与繁殖期收集亲体进行催产的效果相比，提前收集星虫亲体有较大的优点，一是成活率高，其可能的原因是如果亲体在繁殖季节收集，期间海水温度较高，在采捕、运输过程中容易出现受损，而且处于繁殖期，亲体的生理状态比较活跃，易受外界环境的干扰；二是产卵时间长，培育的亲体可在产卵池内连续产卵2～3个月。关于星虫催产方法，如邹杰等[6，14]在裸体方格星虫催产试验证明，繁殖期采集成熟的亲虫，星虫亲体首次大量产卵后，隔2～7 d经过继续培育可二次自行产卵，二次产卵过后产卵量便下降甚至不再产卵，同时亲体死亡数也大量增加。在之后的研究中，采用室内产卵培育和滩涂恢复养殖相结合的方法，即繁殖期内每次间隔1个月对同一批亲体进行3次人工培育产卵试验，雌虫平均产卵量分别为3.11×104、2.70×104和1.75×104粒，也取得不错的效果，但此方法操作比较困难，亲体的死亡率也较高。

关于可口革囊星虫水泥池人工培育试验，目前仍未见报道。本试验采用与裸体方格星虫类似的培育方法，在室内开展人工亲体培育。在试验过程中，亲体的成活率高，且在整个繁殖季节，产卵高峰间隔周期大概为15 d，这与裸体方格星虫的室内培育产卵规律类似。兰国宝等[8]观察结果发现，裸体方格星虫一般是在大潮期间排放受精卵。对于可口革囊星虫催产，也开展了类似的试验，定期从海区收集亲体进行催产，经阴干刺激后几乎每次都可以获得受精卵。但在大潮期间，亲体催产比较容易成功，产卵量也相对较高。这就进一步说明在自然海区，大潮期间亲虫体腔成熟卵所占的比例较高，催产效果较好。在小潮期间，催产效果不理想，产卵比较零散。其次，亲体的产卵与水温有明显的关系，水温较高时，星虫产卵活动比较频繁。如郭学武等[13]对厦门地区的裸体方格星虫生殖周期的研究结果表明，在7—8月水温最高时，星虫产卵活动最旺盛。Rice等[15]也认为星虫类的繁殖期一般都在当地海水温度较高的季节，亲体产卵往往在水温较高的9—10月。

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