海南省6个养殖罗非鱼群体遗传差异的微卫星分析
2018-03-06，，，，
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(1.海南省海洋与渔业科学院，海南 海口 570206； 2.国家罗非鱼产业技术体系海口综合试验站，海南 海口570100)
海南省罗非鱼养殖开始于1956年，是国内极早开始养殖罗非鱼的省份之一，养殖品种从最初的莫桑比克罗非鱼到20世纪90年代的奥尼罗非鱼、奥利亚罗非鱼，再到现在的杂交品种吉富罗非鱼等，尤其进入2000年以后，海南省罗非鱼产业得到飞速发展，产量从1999年的5.8×104t增加到2010年的27×104t，而后，每年产量基本维持稳定[1]。
微卫星标记具有高度多态性、符合孟德尔遗传、在基因组中广泛分布等优点，已被广泛应用于动植物种质鉴定和遗传结构多样性分析[2-6]。
近年来，多位学者已将微生物标记应用于许多与罗非鱼相关的研究中，如Boris 等[7]利用微生物标记分析了6个红罗非鱼群体的遗传变异，评估了红罗非鱼的育种计划；强俊等[8]研究吉富罗非鱼与奥利亚罗非鱼自繁与杂交 F1代的遗传特性与抗病力，发现杂交后代的抗病力明显提高；李建林等[9]发现 2个吉富罗非鱼群体的遗传多样性水平较高，存在杂合子过剩现象，且具有较强的环境适应能力，选育空间大。本研究拟通过筛选罗非鱼微卫星标记，获得海南省6个养殖罗非鱼[尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)、奥尼罗非鱼(Oreochromisniloticus×O.aureus)、莫桑比克罗非鱼(Oreochromismossambica)、红罗非鱼(Red tilapia，Oreochromisniloticus×O.mossambica)、泰奥罗非鱼(Oreochromisniloticus×O.aureus)、吉富罗非鱼(GIFT strain ofOreochromisniloticus)]群体的等位基因，并用软件Popgen3.2对每一个微卫星位点的等位基因的遗传参数进行分析；此外根据各群体间的遗传相似性指数和遗传距离，采用MEGA3.0邻接法(NJ)构建6个罗非鱼群体的系统发育树，以分析群体间的亲缘关系。加之现在罗非鱼种质资源退化严重，造成鱼苗成活率下降，极大影响了产业的可持续发展，因此，研究罗非鱼群体遗传差异势在必行，亦可为选育优良的罗非鱼品种奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
海南省6个罗非鱼(尼罗罗非鱼、奥尼罗非鱼、莫桑比克罗非鱼、红罗非鱼、泰奥罗非鱼、吉富罗非鱼)群体采集自海南省海口市和文昌市两个地区，其中尼罗罗非鱼、奥尼罗非鱼等5个群体采集的规格约500 g，莫桑比克罗非鱼采集规格为50～100 g，每个群体随机抽取30尾，分别采集其尾鳍样品，保存于无水乙醇中。
1.2 基因组DNA的提取
采用基因组DNA提取试剂盒(天根生物有限公司)提取尾鳍基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提DNA的质量，-20℃保存备用。
1.3 微卫星引物的筛选
在美国汉普郡大学Hubbard基因研究中心网站数据(http：//hcgs.unh.edu/)和Carleton等报道的罗非鱼微卫星引物序列中选取20对微卫星引物，对海南养殖的6个罗非鱼群体(尼罗罗非鱼、奥尼罗非鱼、莫桑比克罗非鱼、红罗非鱼、泰奥罗非鱼、吉富罗非鱼)的DNA样本进行扩增，引物序列由艾基生物技术有限公司合成，引物序列见表1。
表1 微卫星扩增引物序列
续表1
1.4 PCR扩增体系及程序
反应总体积为20μL，其中10×PCR buffer 2.0 μL；MgCl2(25 mmol·L-1)0.8 μL；dNTP(10 mmol·L-1each)0.3 μL；Taq Polymerase(5 U·μL-1)0.2 μL；上下游引物(10 mmol·L-1)各0.5 μL；DNA模板(40～100 ng·μL-1)0.3 μL；灭菌双蒸水14.4 μL。PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s；50～60℃退火30 s；72℃延伸45 s；共25个循环；最后72℃延伸7 min。根据扩增效果调节MgCl2浓度和退火温度，MgCl2浓度为0.8～1.2 mmol·L-1。
1.5 电泳和银染检测
利用浓度为10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(每100 mL中ddH2O 35.0 mL；30% Acylamide/Bis 4.0 mL；10×TBE 9.33 mL；20% AP 3.27 mL；TEMED 117 μL)对微卫星PCR产物进行电泳，PCR产物上样量均为4 μL，DNA Marker上样量为0.5 μL， 200 V电泳2 h左右。然后进行银染3 min，洗涤后进行显色，记录电泳结果。
1.6 等位基因统计与数据处理
对银染后得到的谱带进行整理并用软件Popgen3.2进行分析，对每一个微卫星位点的等位基因的数量进行统计，并计算等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、Shannon’s 多态性指数等遗传参数；此外根据各群体间的遗传相似性指数和遗传距离，采用MEGA3.0邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建6个罗非鱼群体的系统发生树，以分析群体间的亲缘关系。
2 结果与分析
2.1 微卫星电泳及等位基因分析结果
20对微卫星引物能够在6个罗非鱼群体样本(尼罗罗非鱼、奥尼罗非鱼、莫桑比克罗非鱼、红罗非鱼、泰奥罗非鱼、吉富罗非鱼)中稳定重复地扩增出特异片段，非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳部分结果见图1。20对微卫星引物共扩增出68个等位基因，各基因座的等位基因为2～5个，大小为100～300 bp，其中莫桑比克罗非鱼平均有效等位基因数量最高(2.26)，奥尼罗非鱼平均等位基因数量最低(1.99)，表2为微卫星引物的扩增条带统计结果。
注：1～27为红罗非鱼；28～57为吉富罗非鱼；58～85为莫桑比克罗非鱼；86～112为泰奥罗非鱼；113～141为尼罗罗非鱼；142～170为奥尼罗非鱼。
Notes：1～27 was red tilapia，Oreochromisniloticus×O.mossambica；28～57 was GIFT strain ofOreochromisniloticus；58～85 wasOreochromismossambica；86～112 was Thailand strain ofOreochromisniloticus×O.aureus；113～141 wasOreochromisniloticus；142～170 wasOreochromisniloticus×O.aureus.
表2 6个罗非鱼群体微卫星鉴定位点的等位基因数目
续表2
2.2 6个罗非鱼群体的遗传参数分析结果
表3为20个微卫星位点在6个罗非鱼群体的遗传参数分析结果，平均观测杂合度在莫桑比克罗非鱼中最高(0.75)，在尼罗罗非鱼中最低(0.57)；平均期望杂合度和多态信息含量在莫桑比克罗非鱼中最高(0.53，0.44)，在奥尼罗非鱼中最低(0.47，0.38)。Shannon’s 多样性指数在莫桑比克罗非鱼中最高(0.85)，其次分别为泰奥罗非鱼(0.83)、尼罗罗非鱼(0.80)和吉富罗非鱼(0.80)，而奥尼罗非鱼(0.72)最低。
表3 20个微卫星位点在6个罗非鱼群体的遗传参数
2.3 6个罗非鱼群体的遗传距离
遗传距离和遗传相似度分析结果表明：尼罗罗非鱼与泰奥罗非鱼的遗传距离最大(0.21)，遗传相似系数最小(0.81)，说明两者亲缘关系最远；吉富罗非鱼和尼罗罗非鱼的遗传距离最小(0.08)，遗传相似系数最大(0.93)，说明两者亲缘关系最近(表4)。
表4 6个罗非鱼群体间遗传距离(左下部分)和遗传相似度(右上部分)
注：1为奥尼罗非鱼；2为尼罗罗非鱼； 3为莫桑比克罗非鱼； 4为红罗非鱼；5为泰奥罗非鱼； 6为吉富罗非鱼； *为缺省。
Notes：1 wasOreochromisniloticus×O.aureus；2 wasOreochromisniloticu；3 wasOreochromismossambica；4 was red tilapia，Oreochromisniloticus×O.mossambica；5 was Thailand strain ofOreochromisniloticus×O.aureus；6 was GIFT strain ofOreochromisniloticus；* was default.
利用群体间的遗传距离矩阵，在MEGA3.0 软件中采用UPGMA 法绘制6个罗非鱼群体的系统进化树。结果表明，吉富罗非鱼是尼罗罗非鱼中的一个品系，它们属于同一种，并聚成一支；红罗非鱼和莫桑比克罗非鱼聚为一支，再与吉富罗非鱼和尼罗罗非鱼聚为一大支，奥尼罗非鱼和泰奥罗非鱼聚为一支(图2)。
3 讨论
本研究应用的微卫星标记技术是较理想的品种鉴定方法，不仅可准确鉴定同一群体中亲本之间、亲本与杂交种之间的不同种，也可鉴别不同杂交组合的杂种子代，目前，该技术已被广泛应用于研究物种分类、进化及遗传结构，其中Ho、He和PIC等是衡量遗传多样性的重要指标。
Ho是衡量种群遗传变异程度的重要参数，与群体遗传结构变异程度呈正相关，且Ho越高，遗传多样性越丰富[10]。本研究中，6个罗非鱼群体的Ho分别为0.62、0.57、0.75、0.70、0.61和0.59，略高于Dewoody的研究结果[11]，研究结果表明，6个养殖罗非鱼群体的遗传多样性为中等水平，其中奥尼罗非鱼和红罗非遗传多样性指数较低，说明其存在种质退化现象。红罗非鱼虽由尼罗罗非鱼和莫桑比克罗非鱼杂交选育而来，但多态性指数却低于莫桑比克罗非鱼群体，因此可根据本文的研究结果，对其亲本家系进行扩充，扩大繁殖群体规模，提高品种遗传多样性，进而提高该罗非鱼品种的种质质量。泰奥罗非鱼与奥尼罗非鱼都为尼罗罗非鱼与奥利亚罗非鱼的杂交种，但其遗传多样性差异较大，这可能主要源于亲本中本地尼罗罗非鱼与泰国品系的尼罗罗非鱼遗传多样性的差异。
PIC是衡量微卫星位点多态性水平的重要指标。一般情况，当PIC<0.25时微卫星位点低度多态性，当0.25
根据微卫星分析结果建立的系统进化树显示吉富罗非鱼和尼罗罗非鱼的亲缘关系最近，其次是与莫桑比克罗非鱼和红罗非鱼，而与泰奥罗非鱼和奥尼罗非鱼亲缘关系最远。此结果与群体的来源和种属关系相符，也说明本实验所选用的微卫星位点可用于分析6个罗非鱼群体间的亲缘关系。
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