串联双柱固相萃取-高效液相色谱-电喷雾多级质谱法测定盐酸二甲双胍制剂中的盐酸二甲双胍及残留物三聚氰胺和双氰胺

2018-03-05周艳芬王芳焕王泽岚詹海鹃刘万毅

色谱 2018年2期

周艳芬, 王芳焕, 王泽岚, 詹海鹃, 刘万毅, 孟哲*

(1. 宁夏大学化学化工学院, 省部共建煤炭高效利用与绿色化工国家重点实验室, 宁夏银川 750021; 2. 宁夏出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心, 宁夏银川 750001)

二甲双胍作为II型糖尿病临床使用最为普遍的口服降血糖药之一,对于改善糖代谢和胰岛素抵抗等起着重要作用[1,2],是目前用于单纯饮食控制和保护心血管的首选降糖药物[3,4]。此外,长期的临床治疗发现二甲双胍能提高肿瘤患者的生存期,因而受到广泛关注[5,6]。为确保盐酸二甲双胍药品的安全性和有效性,《中华人民共和国药典》2015版二部[7]规定,盐酸二甲双胍制剂中有关物质双氰胺的含量不得超过盐酸二甲双胍标示量的0.02%,其他杂质含量低于0.1%,而对三聚氰胺的限量未作明确规定。在盐酸二甲双胍的合成工艺中,不可避免地会引入杂质三聚氰胺及前驱体双氰胺,二者毒性较大,必须严格控制药品中的残留量,以确保患者用药的安全性和药品的有效性。因此,快速、准确地鉴别及测定盐酸二甲双胍制剂中残留的三聚氰胺和双氰胺,一直是相关制药企业关心的问题,也是确保药品质量安全的关键。

三聚氰胺的检测方法包括衍生化-气相色谱-质谱法[8]、高效液相色谱法[9]、薄层色谱法[10]、毛细管电泳法[11]、高效液相色谱-质谱法[12]和表面增强拉曼散射光谱法[13]等,其检测基质多为乳制品。而针对乳制品中三聚氰胺和双氰胺残留同时检测的研究报道则较少[14-16],其中净化处理是三聚氰胺和双氰胺同时测定的难点。Meng等[16]采用混合型阳离子交换Cleanert PCX固相萃取小柱富集复杂样品中微量的三聚氰胺和双氰胺,三聚氰胺的回收率大于90%,而双氰胺的回收率不到20%。

随着治疗观念的转变,创新药物制剂愈发成为医药界研究的热点[17]。市售二甲双胍制剂包括片剂、缓释片、胶囊和肠溶片等,制剂基质的复杂性对微量的双氰胺和三聚氰胺杂质的同时提取带来了困难。同时测定盐酸二甲双胍制剂中盐酸二甲双胍及残留物双氰胺和三聚氰胺的研究还未见报道。而串联混合模式的固相萃取方法已被证明能够较好地消除基质干扰,最大限度地增加目标分析物的回收率[18,19]。

本文采用超声辅助溶出结合串联双柱固相萃取的前处理技术,建立了高效液相色谱-电喷雾多级质谱(HPLC-ESI/MSn)测定盐酸二甲双胍制剂中盐酸二甲双胍及残留物双氰胺和三聚氰胺的分析方法。ESI/MSn质谱信息对HPLC可能产生的假阳性误判提供进一步确证[20]。该方法中二甲双胍、三聚氰胺和双氰胺的检出限均低于文献报道[14,15],因此该方法既能满足盐酸二甲双胍含量的测定要求,又能满足二甲双胍制剂中相关物质三聚氰胺和双氰胺残留的测定要求,为评价分析盐酸二甲双胍制剂的质量安全提供科学的实验数据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Dionex Ultimate 3000 UHPLC超高效液相色谱仪,配有LTQ-XL增强型线性离子阱质谱仪(ESI源)(美国Thermo Fisher Scientific公司); Kromasil-C18色谱柱(100 mm×4.6 mm, 3.5 μm,瑞典AkzoNobel公司); TGL-16M高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司); QL-866旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器有限公司); HGC-12A氮吹仪(金属浴)(河北润创科技开发有限公司); Cleanert PCX、Cleanert PEP和C18 SPE小柱(规格均为60 mg/3 mL,天津博纳艾杰尔公司); 0.22 μm尼龙滤膜(美国Waters公司)。

甲醇和乙腈(色谱纯,美国Thermo Fisher Scientific公司);甲酸、乙酸(色谱纯,美国Sigma-Aldrich公司)。盐酸二甲双胍、三聚氰胺和双氰胺标准品(日本东京化成工业株式会社),纯度均大于98%,其结构式见图1。其他试剂均为分析纯,实验用水均为去离子水。

图 1 二甲双胍、三聚氰胺和双氰胺的结构式Fig. 1 Structures of metformin, melamine and dicyandiamide

供试样品为盐酸二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司,批准文号:国药准字H20023370;深圳市中联制药有限公司,批准文号:国药准字H44024853;上海上药信谊药厂有限公司,批准文号:国药准字H31022081;北京中惠药业有限公司,批准文号:国药准字H19983069);盐酸二甲双胍缓释片(南昌市飞弘药业有限公司,批准文号:国药准字H20051662;北京万辉双鹤药业有限责任公司,批准文号:国药准字H20041985);盐酸二甲双胍肠溶片(贵州天安药业股份有限公司,批准文号:国药准字H52020960;河北天成药业股份有限公司,批准文号:国药准字H20031134);盐酸二甲双胍肠溶胶囊(北京圣永制药有限公司,批准文号:国药准字H10980064;深圳市中联制药有限公司,批准文号:国药准字H20094132)。以上供试品均购自当地医药公司。

1.2 标准溶液的配制

标准溶液的配制:分别称取盐酸二甲双胍、三聚氰胺和双氰胺标准品各250 mg(精确至0.1 mg),以甲醇为溶剂分别配制成1 000 mg/L的标准储备液,于4 ℃冰箱保存。准确移取一定体积的各目标物标准储备液,以流动相为溶剂配制成10 mg/L的混合标准溶液。

基质匹配标准溶液的配制:取200 mg空白样品(辅料)溶于含0.1%(v/v)乙酸的无水乙醇溶液中,超声30 min,以13 000 r/min离心20 min,移取上层清液作为溶剂，配制10 mg/L的混合基质匹配标准溶液。

1.3 样品前处理

1.3.1 提取

对实际制剂样品进行研磨(胶囊去包衣),过60目筛(0.25 mm),装袋、密封于干燥器中,4 ℃保存。

称取0.05 g(精确至0.1 mg)研磨过筛后的样品粉末,置于10 mL具塞塑料管中,加入5 mL含0.1%(v/v)乙酸的无水乙醇溶液溶解,于室温下超声提取30 min后,以13 000 r/min离心10 min,移取上层清液,置于100 mL容量瓶中,用纯净水定容,待净化。

1.3.2 净化

将Cleanert PCX SPE小柱用串接头串联在Cleanert C18 SPE小柱上方,用3 mL甲醇和3 mL去离子水活化Cleanert PCX-C18串联固相萃取双柱,准确移取20 μL 1.3.1节的待净化液,用纯净水稀释至1 mL后上样。先以3 mL纯净水洗涤小柱,再用3 mL 5%(v/v)氨水甲醇溶液进行洗脱,重复2次,用20 mL氮吹管收集洗脱液,于45 ℃金属浴中氮气吹干,用1 mL的流动相溶解,旋涡1 min,过0.22 μm微孔滤膜,转移至自动进样瓶,待HPLC-ESI-MSn分析。

1.4 色谱条件

Kromasil-C18色谱柱(100 mm×4.6 mm, 3.5 μm);柱温:35 ℃;流动相:0.1%(v/v)甲酸水溶液(A)和甲醇(B);流速:0.30 mL/min。梯度洗脱程序:0～2.0 min, 98%A～95%A; 2.0～7.0 min, 95%A～90%A; 7.0～8.0 min, 90%A～20%A; 8.0～8.5 min, 20%A～98%A; 8.5～10.0 min, 98%A。进样量:10 μL。

1.5 质谱条件

离子源:ESI源,正离子模式;毛细管温度:320 ℃;毛细管电压:4 kV;鞘气流速:25 arb;辅助气流速:10 arb;吹扫气流速:30 arb;多级扫描碰撞气:99.999 9%高纯氦气;全扫描模式的扫描范围:m/z60～300;多级串联扫描模式的扫描范围:m/z40～200。在ESI+模式下,二甲双胍、三聚氰胺及双氰胺的保留时间、一级母离子和二级碎片离子见表1。

表 1 3种目标分析物的保留时间、一级母离子和二级碎片离子Table 1 Retention times, MS1 parent ions and MS2 fragment ions of the three target analytes

* Quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

国家标准方法[21]采用选择性色谱柱(强阳离子交换与反相C18混合填料)(150 mm×4.6 mm, 5 μm)检测原料乳与乳制品中的三聚氰胺,其方法的定量限为2 mg/kg。《中华人民共和国药典》2015版规定采用C18色谱柱配合离子对试剂检测双氰胺[7]。其他研究报道[14,15]多采用选择性氨基色谱柱同时检测食品中的三聚氰胺和双氰胺,氨基色谱柱有利于三聚氰胺和双氰胺的保留,三聚氰胺和双氰胺的定量限分别为0.17 mg/kg和0.15 mg/kg[14]。合格药品制剂中三聚氰胺和双氰胺的残留量很低,而且制剂基质成分复杂,因此不适合选用以上选择性色谱柱同时分离二甲双胍、三聚氰胺及双氰胺3种目标物。本实验采用Syncronis-C18超高效液相色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美国Thermo Fisher Scientific公司)和Kromasil-C18高效液相色谱柱(100 mm×4.6 mm, 3.5 μm,瑞典Akzo-Nobel公司)对0.1 mg/L的混合标准溶液进行分离。结果表明，Kromasil-C18柱对三聚氰胺、二甲双胍和双氰胺的保留(保留时间分别为3.46、3.56和4.01 min)优于Syncronis-C18色谱柱(保留时间分别为0.98、1.20和1.31 min); Kromasil-C18色谱柱对三聚氰胺、二甲双胍和双氰胺的分离效果优于Syncronis-C18色谱柱。因此选择Kromasil-C18色谱柱用于分析。

在选择Kromasil-C18色谱柱的条件下,首先考察了甲醇-水、乙腈-水作为流动相对3种目标化合物的色谱行为和离子化程度的影响。结果表明,当流动相为甲醇-水时,仪器响应值高于乙腈-水为流动相时的响应值,且目标化合物在甲醇-水流动相中的色谱分离效果优于乙腈-水。此外,还考察了在甲醇-水流动相体系的水相中分别加入0.1%(v/v)甲酸、0.1%(v/v)乙酸、5 mmol/L乙酸铵等挥发性添加剂的影响。结果表明,以甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液为流动相时,混合标准溶液(0.1 mg/L)中3种目标化合物获得了最优的色谱分离效果和相对丰度最强的质谱信号响应(提取离子流色谱图见图2)。这是由于目标物二甲双胍、三聚氰胺和双氰胺具有弱碱性,当流动相中加入一定量的酸性物质(如甲酸)时,会促进目标物的电离,并为阳离子的形成提供必需的质子来源,从而提高其离子化效率。

通过对比3种目标分析物(0.1 mg/L)在混合标准溶液和基质加标溶液中的提取离子流色谱图,可以看出基质效应不影响目标物的保留时间(ΔtR<0.1 min),但对3种目标物离子化信号强度存在一定程度的抑制,尤其对双氰胺影响较大,所以定量分析应采用基质加标工作曲线。

2.2 质谱条件的优化

为获得目标化合物的最佳质谱参数,实验采用针泵直接进样,分别测定了每一种化合物在ESI+和ESI-模式下的质谱信号强度。在ESI+电离模式下,二甲双胍、三聚氰胺和双氰胺均易得到响应强度较高的[M+H]+准分子离子峰,m/z分别为130.01、127.07和85.07。多级串联扫描模式测定可以同时获得化合物的多个特征碎片离子信息,使化合物的确认更加准确。通过对目标化合物母离子碰撞能的优化,裂解电压在30 V时得到3种分析物的二级碎片离子及裂解规律(见图3)。根据多级串联质谱扫描结果,在全扫描模式下选择离子丰度高、干扰小的母离子与特征碎片离子及对应的保留时间用于目标物的定性分析;选择灵敏度较高的选择离子扫描模式(SIM)用于目标分析物的定量分析。

图 3 3种目标化合物在ESI+模式下的二级质谱图Fig. 3 MS2 spectra of the three target compounds in ESI+mode

2.3 提取液的选择

市售二甲双胍制剂包括片剂、缓释片、胶囊和肠溶片等,制剂基质的复杂性取决于药品生产和调配处方时所用的赋形剂和附加剂[17]。我国常用药品辅料包括防腐剂、抗氧化剂、矫味剂和表面活性剂等。由于药用辅料的品种较多,成分复杂,造成了药品制剂中微量杂质检测的困难。二甲双胍片剂和胶囊制剂易溶于水,而缓释片和肠溶片制剂遇水膨胀呈胶状而不溶。在超声辅助下,分别比较了0.1%(v/v)乙酸水溶液、甲醇-水(1∶1, v/v)溶液、50%(v/v)甲醇水溶液(含0.1%(v/v)乙酸)、乙醇-水(1∶1, v/v)溶液和含0.1%(v/v)乙酸的无水乙醇溶液溶解二甲双胍制剂的效果。研究过程发现,含0.1%乙酸(v/v)的无水乙醇溶液能够快速地溶解二甲双胍片剂、胶囊、缓释制剂和肠溶制剂,而其他溶剂不能有效地溶解所有剂型，因此选为实验所用。

在HPLC-ESI-MSn分析中,基质效应更多是伴随被分析物共流出喷雾针的内源性物质产生的，其干扰被分析物的雾化、挥发、裂解及带电荷过程，导致最终进入质谱的离子减少(离子抑制)或增强(离子增强),从而影响定量结果的可靠性和准确性[22,23]。考虑到制剂辅料的基质效应,本研究在超声辅助、含0.1%(v/v)乙酸的无水乙醇溶液溶解制剂样品后加标,采用串联Cleanert PCX-C18固相萃取双柱浓缩和净化目标物,利用HPLC-ESI-MSn分析检测,基质匹配标准曲线计算,分别考察了不同盐酸二甲双胍制剂(片剂、胶囊、缓释制剂及肠溶制剂)样品加标后辅料基质对目标化合物(0.1 mg/L)保留时间和离子化信号的影响(见图4)。结果显示,目标化合物二甲双胍、三聚氰胺和双氰胺在不同制剂样品中的平均加标回收率为86.8%、101.1%和70.4%。实验结果表明,超声辅助和采用含0.1%(v/v)乙酸的无水乙醇溶液作为溶剂对制剂样品中的分析物具有很好的溶出能力。采用基质匹配标准曲线计算可有效地补偿不同制剂辅料存在的基质效应；采用串联双柱富集净化目标物提高了双氰胺的回收率。

图 4 3种目标化合物(0.1 mg/L)在不同盐酸二甲双胍制剂中的加标回收率(n=3)Fig. 4 Spiked recoveries of the three target compounds (0.1 mg/L) in different metformin hydrochloride preparations (n=3)

CompoundRegressionequationr2Linearrange/(μg/L)LOD/(μg/kg)LOQ/(μg/kg)Metforminy=2.27×105+1.13×103x0.999210-100002.628.65Melaminey=1.86×105+1.29×103x0.999410-100001.485.96Dicyandiamidey=1.80×104+2.83×102x0.999950-1000013.6145.67

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

2.4 固相萃取柱和洗脱剂的优化

图 5 不同固相萃取柱和洗脱剂对目标化合物回收率的影响Fig. 5 Effect of different SPE cartridges and eluents on recoveries of the target compounds

盐酸二甲双胍、三聚氰胺和双氰胺均呈现弱碱性,文献报道[14,15]多采用Cleanert PCX小柱浓缩和净化该类化合物。实验分别采用Cleanert PCX、Cleanert PEP、C18和串联Cleanert PCX-C18固相萃取双柱浓缩和净化加标样品,同时考察了不同洗脱溶剂(含0.1%(v/v)乙酸的甲醇溶液、甲醇和5%(v/v)氨水甲醇溶液,碱性逐渐增加)对目标化合物回收率的影响(见图5)。采用控制变量法和基质匹配标准曲线定量计算,对比3种目标化合物的回收率。实验发现,随着洗脱剂碱性的增大,无论采用何种固相萃取柱净化,二甲双胍、三聚氰胺和双氰胺3种目标物的回收率均有所提高。表明5%(v/v)氨水甲醇洗脱剂的洗脱能力较强,其原因是洗脱剂中的铵根离子与柱上吸附的目标化合物发生离子交换。对比采用5%(v/v)氨水甲醇作为洗脱剂时3种目标物的回收率,发现二甲双胍、三聚氰胺和双氰胺经串联的Cleanert PCX-C18双柱净化后的回收率均高于采用其他固相萃取小柱。综合上述结果,本实验采用串联Cleanert PCX-C18双柱,以5%(v/v)氨水甲醇为洗脱剂,不仅实现了快速除去制剂药液中各种药物辅料的目标,获得较高回收率和灵敏度,还有利于保护色谱柱和电离源。

2.5 标准曲线、线性范围和检出限

在上述1.3节和1.4节的条件下,采用基质匹配混合标准工作溶液(0.01～20 mg/L)，以目标化合物的质量浓度为横坐标(x, μg/L)、对应的峰面积为纵坐标(y)绘制基质匹配标准曲线。结果表明,3种目标化合物在一定范围内呈现良好的线性关系,相关系数(r2)≥0.999 2(见表2)。以S/N=3和S/N=10时的质量浓度为检出限(LOD)和定量限(LOQ),由表2可知,二甲双胍、三聚氰胺和双氰胺的LOD值分别为2.62、1.48和13.61 μg/kg, LOQ值分别为8.65、5.96和45.67 μg/kg,均优于文献方法[14,15]。

2.6 回收率和精密度

在1.3节和1.4节条件下,向二甲双胍片剂样品中添加50、100和500 μg/L的混合标准溶液,采用基质匹配标准曲线进行回收率测定,每个加标水平下分别测定5份平行样品。结果显示,二甲双胍、三聚氰胺和双氰胺在3个加标水平下的平均回收率均不小于80.45%、90.30%和65.02%,其相对标准偏差均不大于10.65%、8.34%和13.41%(见表3)。

表3 盐酸二甲双胍片剂样品中3种目标物的平均加标回收率和相对标准偏差(n=5)Table3 AveragespikedrecoveriesandRSDsofthethreetargetcompoundsinmetforminhydrochloridetabletsamples(n=5) Compound50μg/LRecovery/%RSD/%100μg/LRecovery/%RSD/%500μg/LRecovery/%RSD/%Metformin80.4510.6590.056.9095.406.10Melamine90.308.34102.235.56118.334.22Dicyandiamide65.0213.4170.528.0178.027.73

对每个加标样品进行精密度试验，日内连续测定5次,连续测量5天,日内和日间回收率的RSD小于15%,重复性良好，满足药品制剂中残留杂质的检测要求。

2.7 实际样品检测

将本方法用于4种盐酸二甲双胍制剂(10个样品)中二甲双胍及残留物三聚氰胺和双氰胺的确证及测定。依据化合物的保留时间和质谱信息中离子相对丰度比来确认样品中的目标物,根据基质匹配标准曲线测定样品中相应的目标物含量(见表4)。由表4可知,所有二甲双胍制剂样品中均发现双氰胺和三聚氰胺残留。依据《中华人民共和国药典》2015版二部的规定,双氰胺的限量低于盐酸二甲双胍标示量的0.02%,通过计算实际样品中残留双氰胺与二甲双胍的比值,各种制剂中双氰胺的残留量均有超过限量0.02%的情况,所以严格监管二甲双胍制剂中双氰胺的残留量非常必要。在所有制剂中,三聚氰胺的检出率均为100%,但其残留量均低于方法的定量限,无法准确定量。

表 4 不同盐酸二甲双胍制剂样品中3种目标物的含量(n=5)Table 4 Contents of the three target compounds in different metformin hydrochloride preparation samples (n=5)

3 结论

本文以含0.1%(v/v)乙酸的无水乙醇溶液作为提取剂,超声辅助提取盐酸二甲双胍制剂中的主要成分盐酸二甲双胍及残留物三聚氰胺和双氰胺,采用串联Cleanert PCX-C18固相萃取双柱浓缩、净化,建立了HPLC-ESI-MSn法测定盐酸二甲双胍制剂中二甲双胍及制剂残留杂质三聚氰胺和双氰胺。该方法完全能够满足国内外对二甲双胍不同制剂(片剂、胶囊、缓释片和肠溶片)中主要成分盐酸二甲双胍和残留物三聚氰胺和双氰胺的测定。

[1] Mu Y M, Ji L N, Ni G, et al. Chinese Journal of Diabetes, 2014, 22(8): 673

母义明, 纪立农, 宁光, 等. 中国糖尿病杂志, 2014, 22(8): 673

[2] Xu X N, Shi R, Ma Y M. Acta Pharmaceutica Sinica, 2017, 52(6): 865

许希宁, 石荣, 马越鸣. 药学学报, 2017, 52(6): 865

[3] Liu S N, Liu Q, Sun S J, et al. Acta Pharmaceutica Sinica, 2014, 49(11): 1554

刘率男, 刘泉, 孙素娟, 等. 药学学报, 2014, 49(11): 1554

[4] Fang L J, Liu N F. Chinese Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 2011, 16(2): 232

方丽娟, 刘乃丰. 中国临床药理学与治疗学, 2011, 16(2): 232

[5] Zhang J, Shen C W, Wang L, et al. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 452(3): 746

[6] Guo H R, Xu G F, Zhang H. Journal of Modern Oncology, 2017, 25(3): 490

郭海瑞, 徐桂芬, 张华. 现代肿瘤医学, 2017, 25(3): 490

[7] Pharmacopoeia Commission of the People’s Republic of China. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China, Part 2. Beijing: China Medical Science Press, 2015

国家药典委员会. 中华人民共和国药典, 二部. 北京: 中国医药科技出版社, 2015

[8] Li D G, Ju F L, Li C J. Chemical Analysis and Meterage, 2009, 18(2): 24

李东刚, 鞠福龙, 李春娟. 化学分析计量, 2009, 18(2): 24

[9] Chen M S, Jing W, Lü S Y, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2011, 39(10): 1572

陈旻实, 井伟, 吕水源, 等. 分析化学, 2011, 39(10): 1572

[10] Meng L H, Liu X K, Guo J. China Dairy Industry, 2011, 39(6): 60

孟兰环, 刘兴凯, 郭军. 中国乳品工业, 2011, 39(6): 60

[11] Chen X, Yuan H P, Cao Y H, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2011, 39(9): 1418

陈新, 袁红萍, 曹玉华, 等. 分析化学, 2011, 39(9): 1418

[12] Yun H, Yan H, Zhang Z H, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2013, 31(5): 404

云环, 严华, 张朝晖, 等. 色谱, 2013, 31(5): 404

[13] Qu G, Zhang G N, Su Y, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2014, 42(7): 1022