血栓通胶囊对氧糖剥夺/复氧致 HUVEC 细胞紧密连接损伤的改善作用

杨爱玲，武 汀，张天睿，韩 冰，孙建宁，张硕峰*

(1.北京中医药大学，北京 100029； 2.哈尔滨珍宝制药有限公司，哈尔滨 150060)

血栓通胶囊 (xueshuantong, XST)[1]是开发的一种血栓通注射液改良口服制剂，其主要成分为三七总皂苷 (panax notoginseng saponins，PNS)，主要作用是活血祛瘀，通脉活络。临床上常用于中风偏瘫、胸痹心痛。此课题前期结果显示，PNS对脑缺血再灌注模型小鼠脑微血管白蛋白渗出有抑制作用。但是，PNS对缺血致血管紧密连接损伤的保护作用及其内在调控机制未见报道，亟待深入研究。因此，本实验借助Transwell小室，构建HUVEC细胞紧密连接模型，考察PNS对氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation and re-oxygenation，OGD/R)致细胞紧密连接损伤的改善，从体外角度考察PNS对缺血致内皮紧密连接损伤的保护作用，探讨PNS有效单体成分，为PNS口服制剂的临床应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 药品与试剂

血栓通胶囊原料三七总皂苷，哈尔滨珍宝制药有限公司提供，为类白色至淡黄色无定形粉末，味苦，微甘，批号20111201，主要单体成分为Rg1(31.1%)、Rb1(33.8%)、Rd(7%)、Re(3.9%)、R1(9.2%)，试验前用PBS配制。

ECM培养基(1001)，批号19130，Sciencell公司；无糖培养基，Gibco 公司；fluorescein isothiocyanate-dextran 70 kD(FD70S)，批号SLBG0356 V，Sigma公司；Transwell细胞小室，BD公司；Prolong Gold antifade reagent with DAPI(P36941)，批号 1753492，Thermofisher 公司；封闭用正常羊血清ZLI-9022，批号 WK153325，中杉金桥生物技术有限公司；厌氧产气条，批号 1003976390，BioMerieux公司；厌氧指示条(96118)，批号 1004170150，BioMerieux公司；甲醇，批号20021022，北京化工试剂厂。

1.2 主要仪器

MERS00002电阻仪，由Millipore公司生产；厌氧盒，由BioMerieux公司生产；圆形细胞爬片(24孔)，型号WHB-24-CS，WHB 生产；压力蒸汽灭菌器，超净工作台，由上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产；电热恒温鼓风干燥箱，由黄石市恒丰医疗器械有限公司生产；细胞培养箱，由美国 Revco 公司生产；倒置显微镜，由德国Leica 公司生产；台式低温离心机，由北京众益中和生物技术有限公司生产。

1.3 实验方法

1.3.1 内皮间紧密连接电阻

将 HUVEC细胞按照1.0×105/cm2接种于Transwell 24 孔板，上室300 μL培养液，下室700 μL培养基，采用EVOM2电阻仪检测跨内皮电阻(transendothelial electrical resistance， TEER)值，通过减去空白对照没有接种细胞小室膜的TEER值，得到该小孔细胞的TEER值。自TEER值即将稳定作为起始开始记录。

待 Transwell 中内皮细胞培养4 d 达到完全融合，将细胞培养基换成无糖培养基置缺氧箱中缺氧6 h后，换成正常ECM内皮培养基置37℃，5% CO2培养箱中再灌注24 h，检测TEER值。给药组设定PNS终浓度为10、20、40 μg/mL；人参皂苷Rb1 13.52 μg/mL；人参皂苷Rg1 12.44 μg/mL。

1.3.2 内皮细胞间渗透性

将HUVEC按照1.0×105/cm2接种于24 孔板，上室300 μL培养液，下室700 μL培养基，待 Transwell 中内皮细胞培养4 d达到完全融合，开始实验。

在 Transwell上室中加入终浓度为1 mg/mL FITC-葡聚糖(70 kd)的无糖培养基200 μL，下室加入无糖培养基700 μL，置缺氧盒中缺氧6 h后，以正常 ECM 完全培养基替换无糖培养基，置正常培养箱复氧24 h后，在每个下池取样品100 μL，置于96孔板中，用多功能酶标仪测定荧光强度，激发波长为490 nm，发射波长为520 nm，检测渗透到下室FITC-葡聚糖的荧光强度。给药组设定PNS终浓度为10、20、40 μg/mL；人参皂苷Rb1 13.52 μg/mL；人参皂苷Rg1 12.44 μg/mL。依据FITC-葡聚糖的荧光强度判断葡聚糖渗透到外池的量，从而判断 PNS对紧密连接蛋白的调控。

1.3.3 免疫荧光

取出已固定好的内皮细胞爬片，置常温甲醇中，移至-40℃固定30 min，取出置室温10 min，PBS漂洗10 min×3次；加入封闭液，37℃封闭30 min；加入兔抗大鼠ZO-1(1∶100)、claudin-5(1∶100)37℃孵育1 h，PBS漂洗10 min×3次；加入二抗FITC标记羊抗兔以及FITC标记羊抗小鼠，避光，37℃孵育30 min；PBS漂洗5 min×3 次；加入含DAPI封闭液，避光，室温孵育5 min，PBS漂洗5 min×2次，30%甘油封片，指甲油固定，置荧光显微镜下观察并拍照。

2 结果

2.1 三七总皂苷及人参皂苷 Rb1、Rg1改善氧糖剥夺致HUVEC细胞电阻值损伤

PNS 20、40 mg/L组能够显著抑制模型组紧密连接电阻的降低(模型组，65±5.0 Ω；PNS 20、40 mg/L分别为 95±4.6 Ω、101±6.0 Ω；P< 0.01，P< 0.05)。人参皂苷Rb1能够显著升高OGD 6 h复氧24 h后内皮紧密连接电阻(模型组，75±6.4 Ω；Rb1 13.52 mg/L 97±2.0 Ω)。人参皂苷Rg1 对 HUVEC细胞紧密连接电阻值无明显影响。(见图1～2)

注：A:正常对照组；B:模型组；C: PNS 10 mg/mL；D: PNS 20 mg/mL；E: PNS 40 mg/mL；与模型组对比，*P< 0.05，**P< 0.01。图1 PNS对氧糖剥夺致HUVEC细胞电阻值损伤改善作用Note.A: Control group.B: Model group.C: PNS 10 mg/mL.D: PNS 20 mg/mL.E: PNS 40 mg/mL.Compared with the model group, *P< 0.05，**P< 0.01.Fig.1 Effects of PNS on the transendothelial electrical resistance of HUVEC cells after OGD 6 h/Reox 24 h

注：A:正常对照组；B:模型组；F: Rb1 13.52 mg/mL；G: Rg1 12.44 mg/mL；与模型组对比，*P< 0.05，**P< 0.01。图2 人参皂苷Rb1、Rg1对氧糖剥夺致HUVEC细胞电阻值损伤改善作用Note.A: Control group.B: Model group.F: Rb1 13.52 mg/mL.G: Rg1 12.44 mg/mL.Compared with the model group, *P< 0.05，**P< 0.01.Fig.2 Effects of Rb1 and Rg1 on the transendothelial electrical resistance (TEER) of HUVEC cells after OGD 6 h/Re 24 h treatment

2.2 三七总皂苷及人参皂苷 Rb1、Rg1改善氧糖剥夺致HUVEC细胞渗透性损伤

PNS 20、40 mg/L组能够显著抑制内皮细胞渗透性的升高(正常对照组，0.082±0.00；模型组，0.097±0.01；PNS 20、40 mg/L分别为 0.085±0.00，0.086±0.01；P< 0.01)。人参皂苷Rb1能够显著抑制OGD 6 h复氧24 h后内皮细胞渗透性的升高(正常对照组，0.083±0.00，模型组，0.10±0.01；Rb1 13.52 mg/L 0.087±0.00)。人参皂苷Rg1 对 HUVEC细胞渗透性增加无明显影响。(见图3～4)

注：A:正常对照组；B:模型组；C: PNS 10 mg/mL；D: PNS 20 mg/mL；E: PNS 40 mg/mL；与模型组对比，*P< 0.05，**P< 0.01。图3 三七总皂苷对氧糖剥夺致内皮细胞渗透性损伤的改善作用Note.Note.A: Control group.B: Model group.C: PNS 10 mg/mL.D: PNS 20 mg/mL.E: PNS 40 mg/mL.Compared with the model group, *P< 0.05，**P< 0.01.Fig.3 Effects of PNS on the permeability of HUVEC cells after OGD 6 h/Re 24 h treatment

注：A:正常对照组；B:模型组；F: Rb1 13.52 mg/mL；G: Rg1 12.44 mg/mL；与模型组对比，*P< 0.05，**P< 0.01。图4 人参Rb1、Rg1对氧糖剥夺致内皮细胞渗透性损伤的改善作用Note.A: Control group.B: Model group.F: Rb1 13.52 mg/mL.G: Rg1 12.44 mg/mL. Compared with the model group, *P< 0.05，**P< 0.01.Fig.4 Effects of Rb1 and Rg1 on the permeability of HUVEC cells after OGD 6 h/Re 24 h treatment

2.3 三七总皂苷及其单体对氧糖剥夺/复氧复糖致 HUVEC 细胞紧密连接蛋白损伤的改善作用

正常组HUVEC 细胞的ZO-1及claudin-5蛋白主要分布于临近细胞膜，排列连续，显示出内皮细胞的典型铺路石排列。缺氧6 h复氧24 h损伤后，细胞边缘的紧密连接蛋白显著减少，环形结构断裂，甚至消失，细胞核内紧密连接蛋白呈增加趋势。PNS 20、40 mg/L及Rb1 13.52 mg/L组可观察到细胞间紧密连接局部恢复。PNS 10 mg/L、Rg1 12.44 mg/L组没有观察到明显变化。(见图5～6)

3 讨论

血管内皮细胞间紧密连接(tight junction，TJ)是维持粘血管通透性和机械屏障的重要结构[2-5]：紧密连接调节着离子和大分子物质的跨细胞旁路的被动转运，只允许离子及小分子可溶性物质通过，而不允许毒性大分子及微生物通过。内皮细胞间紧密连接一旦发生变异、减少或缺失，血管通透性就会增加，细菌、内毒素及大分子物质就可通过紧密连接进入体循环。因此，紧密连接在血管屏障功能中的作用至关重要，阐明其分子结构及调控机制，对认识屏障功能及防治相关疾病的发生具有重要意义。

体外内皮屏障功能的研究中，内皮细胞电阻和内皮渗透性是评价体外细胞紧密连接形成与否的黄金指标。细胞间连接构成了循环细胞及大分子物质从血液到组织的重要屏障，稳定了血管内液体的胶体渗透压，维持血管张力，允许血浆和循环的白细胞的选择性通过，确保生理功能的正常，包括紧密连接、粘附连接和缝隙连接。其中，紧密连接是脑微血管内皮细胞间主要连接方式，构成血管屏障的结构功能基础。Transwell，又称为细胞小室，已广泛用于细胞共培养、细胞侵袭、细胞迁移和细胞趋化方面的研究，较好地模拟了血脑屏障、肠粘膜屏障、胎盘屏障、腹透屏障及视网膜屏障等生物屏障。本实验借助Transwell小室，构建HUVEC细胞紧密连接模型，考察了PNS对氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation and re-oxygenation，OGD/Reox)致细胞紧密连接损伤的改善情况，并探讨了PNS有效单体成分。

Shimotake等[6]发现蛋白C的活化能够通过上调血管紧张素1及其受体Tie2的表达，抑制 HUVEC 内皮通透性的增加，上调紧密连接 ZO-1的表达。以往研究显示，PNS 50、100 mg/L可抑制β-淀粉样蛋白42所致BalB/c小鼠微血管内皮细胞活力降低，上调ZO-1蛋白的表达[7]；PNS 25、50、100 mg/L能够抑制铝暴露24 h致脑微血管内皮细胞BalB/c细胞基因及蛋白的表达的降低。本实验结果显示，PNS 20、40 mg/L可以显著抑制OGD致HUVEC内皮细胞电阻的降低，抑制OGD致HUVEC内皮细胞 FITC-葡聚糖的渗出，显著促进OGD损伤后紧密连接蛋白ZO-1及claudin-5的再度融合，发挥对缺氧缺糖诱导下内皮屏障功能损伤的保护作用。PNS 10 mg/L对OGD 致HUVEC 紧密连接损伤没有显著影响。杨丽鹍等[8]、 Chen等[9]采用MCAO致脑缺血再灌注损伤模型小鼠，观察到人参皂苷 Rb1 能够显著降低术后48 h脑水肿增加，降低伊文思蓝的渗出，并通过降低 MMP-9以及NOX4的表达上调紧密连接蛋白ZO-1、occludin 的表达。本实验结果显示，人参皂苷Rb1能够显著抑制OGD致HUVEC内皮电阻的降低，抑制OGD致HUVEC内皮细胞 FITC-葡聚糖的渗出，并能够促进OGD损伤后紧密连接蛋白ZO-1及claudin-5的再度融合。

注：a：正常对照组；b：模型组；c：三七总皂苷10 mg/L组；d：三七总皂苷20 mg/L；e：三七总皂苷40 mg/L；f：人参皂苷Rb1 13.52 mg/L；g：人参皂苷Rg1 12.44 mg/L。图5 三七总皂苷及其单体成分人参皂苷Rb1、Rg1对氧糖剥夺致HUVEC 细胞的ZO-1蛋白的改善作用(免疫荧光染色，Bar=100 μm)Note.a：Control group.b：OGD 6 h/Re 24 h group.c：PNS 10 mg/L group.d：PNS 20 mg/L group.e：PNS 40 mg/L group.f：Rb1 13.52 mg/L group.g：Rg1 12.44 mg/L group.Fig.5 Effects of PNS and Rb1/Rg1 on ZO-1 in HUVEC cells after OGD 6 h/R24 h treatment. Immunofluorescence staining.

注：a：正常对照组；b：模型组；c：三七总皂苷10mg/L组；d：三七总皂苷20mg/L；e：三七总皂苷40mg/L；f：人参皂苷Rb113.52mg/L；g：人参皂苷Rg112.44mg/L。 图6 三七总皂苷及其单体成分人参皂苷Rb1、Rg1对氧糖剥夺致HUVEC细胞的Claudin-5蛋白的改善作用(免疫荧光染色，Bar=100μm) Note.a:Controlgroup.b:OGD6h/Reox24hgroup.c:PNS10mg/Lgroup.d:PNS20mg/Lgroup.e:PNS40mg/Lgroup.f:Rb113.52mg/Lgroup.g:Rg112.44mg/Lgroup. Fig.6 EffectsofPNSandRb1/Rg1onclaudin-5intheHUVECcellsafter OGD6h/Reox24htreatment.Immunofluorescencestaining

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