全长与成熟形式IL-37b的真核表达载体的构建与研究

李梦媛，韦荣飞，杨星九，朱瑞敏，高 苒

(中国医学科学院医学实验动物研究所，北京 100121)

IL-37是IL-1家族细胞因子，曾经被命名为IL-1F7[1]，在人体多种组织、器官中都有表达；在多种人源细胞系中也能够检测到IL-37，如THP-1、U937、A431、IMTLH、KG -1、HL60、HPBMC、HPT4和NHDC细胞等[2-4]。小鼠体内并未发现IL-37同类细胞因子的表达[5]，因此小鼠及其来源的细胞系能够排除背景干扰，作为较理想的对象应用于IL-37的研究。IL-37共有6个外显子，IL-37b是IL-37五种亚型a～e中序列最长的一个，全长的IL-37b共有218个氨基酸，含有外显子1、2、4、5、6[6]，并在1号外显子处有caspase-1酶切位点，能够经其切割转变为成熟形式的IL-37b[7]，下文中分别将二者命名为FL-IL-37b(full-length-IL37b)与M-IL-37b(mature-IL-37b)。目前，大量研究已证明IL-37b具备生物学活性，能够作为炎症抑制因子在多种炎症性疾病中发挥功能，同时，这些疾病引起的炎症反应也能够上调IL-37b的表达[8-12]。本实验中构建的IL-37b真核表达载体旨在为人类炎症性疾病病理机制的研究提供基础，并为疾病的治疗方案提供潜在的新方法。

1 材料和方法

1.1 材料

含有全长IL-37b编码区基因的质粒pUBC 2(+)以及载体质粒pEGFP N1由本实验室制备保存。

T4连接酶、限制性内切酶购自NEB公司；DNA分子量marker、PCR Premix Taq购自TaKaRa公司；RAW 264.7细胞购自中国医学科学院基础医学研究所；IL-37抗体购自Abcam公司；HRP标记的山羊抗兔IgG购自中杉金桥生物公司；LPS(Lipopolysaccharide)购自Sigma公司；转染试剂Lipofectamine 2000、TRIzol试剂购自Invitrogen公司；预染蛋白分子量marker、反转录试剂盒、8孔腔室载玻片等购自Thermo公司；质粒提取试剂盒购自Qiagen公司；SYBR green real-time PCR Master Mix购自Toyobo公司；荧光定量PCR仪专用96孔板与封板膜购自ABI公司；实时荧光定量PCR仪为ABI Step One Plus Real-Time PCR System；共聚焦显微镜为Leica Microsystems；引物合成与DNA测序服务由英潍捷基(上海)公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 IL-37b基因的克隆与pEGFP N1/IL-37b真核表达载体的构建

全长与成熟形式的IL-37b基因模板来自本实验室制备的含IL-37b全长编码区基因的质粒pUBC/IL-37b。以该质粒为模板，通过PCR技术对FL-IL-37b与M-IL-37b编码区基因进行扩增。上、下游引物序列见表1，下划线为EcoR I和Xho I酶切位点，PCR反应条件为：95℃ 3 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，扩增30个循环；72℃延伸10 min，预计目的基因片段大小分别为654 bp、519 bp。采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，并对目的条带DNA进行回收，用于连接构建真核表达载体。用限制性内切酶EcoR I和Xho I分别对目的基因的PCR产物与表达载体pEGFP N1进行双酶切，再次进行琼脂糖凝胶电泳，通过胶回收纯化收集酶切产物，于16℃环境过夜连接，构建表达载体。次日，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，吸取约200 μL转化液均匀涂布于具有卡那霉素抗性的LB平板上，在37℃培养箱中倒置培养过夜。次日，挑选若干菌落进行PCR，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定结果后，将阳性克隆进行DNA测序，鉴定IL-37b基因片段是否正确插入，阳性克隆质粒命名为pEGFP N1/IL37b。

表1 IL-37b基因引物序列

1.2.2 RAW 264.7细胞的培养与表达载体的转染

将RAW 264.7细胞制成浓度为每毫升5×104个的细胞悬液，分别接种于8孔腔室载玻片与12孔细胞培养板，37℃培养至细胞贴壁。按照转染试剂Lipofectamine2000说明书步骤将pEGFP N1/IL-37b质粒转染至8孔腔室载玻片与培养板的细胞中。转染完毕更换培养基后加入工作浓度为500 ng/mL的LPS，继续培养16～18 h。

1.2.3 Western blot检测转染后细胞中IL-37b蛋白的表达

收集12孔培养板中的细胞，用RIPA裂解液裂解并提取蛋白。配制浓度为12%～15%的分离胶，将细胞裂解液进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后进行转膜，将蛋白条带电转至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，减少非特异性结合后，按1∶1000的比例用IL-37抗体4℃孵育过夜。次日，用0.1%的PBST洗膜，加入按1∶5000比例稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG，室温作用1 h。洗膜后加显影液，观测蛋白条带。

1.2.4 共聚焦显微镜检测转染后细胞中IL-37b的表达与定位

弃去8孔腔室载玻片中的培养基，用PBS洗涤细胞后，用4%多聚甲醛溶液固定细胞10 min。洗去多余的固定液，用0.2%的Triton X-100冰上通透细胞10 min。再次洗涤细胞后，用DAPI避光孵育细胞10 min，对细胞核进行染色。染色后用PBS洗涤细胞一次，除去8孔腔室，留下下方有细胞贴附的载玻片，用中性树脂封片。待中性树脂晾干后，在Leica共聚焦显微镜下观察细胞中FL-IL-37b与M-IL-37b的表达情况并拍照记录。

1.2.5 Real-time PCR检测转染细胞中IL-37b的抑制作用

收集12孔细胞培养板中的细胞，按照TRIzol说明书与Thermo反转录试剂盒说明书的步骤提取细胞总RNA，并对RNA进行反转录，获得cDNA。通过real-time PCR检测细胞中IL-6的相对表达量。GAPDH与IL-6基因的引物序列如表2所示，real-time PCR的反应体系如表3所示，反应条件为：保温，95℃ 3 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，扩增40个循环；熔解曲线为60℃～95℃升温。

表2 Real-time PCR引物序列

表3 Real-time PCR反应体系

1.3 统计学方法

应用GraphPad Prism V.5.0软件对数据进行t检验及统计学分析，计量资料以平均数±标准差(x±s)表示，以P< 0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 IL-37b基因的PCR扩增产物与重组质粒的鉴定

M-IL-37b与FL-IL-37b基因的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，在500～750 bp之间有两条明亮的条带，一条接近500 bp，为M-IL-37b基因扩增的产物；另一条约在650 bp附近，为FL-IL-37b基因扩增的产物，与预期的目的基因大小相符。重组质粒单克隆菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示，阳性的菌落在与M-IL-37b与FL-IL-37b基因相近的位置各有一条明亮的特异性条带。对阳性克隆菌落进行DNA测序，结果显示IL-37b基因片段正确插入pEGFP N1质粒，碱基无突变，可进行下一步的转染实验。

注：M：Marker；1：成熟IL-37b；2：全长IL-37b；3：阴性对照；4：成熟IL-37b阳性克隆菌落；5：全长IL-37b阳性克隆菌落。图1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳Note.M：Marker.1:M-IL-37b.2:FL-IL-37b.3:Negative control. 4: Positive colony of M-IL-37b. 5: Positive colony of FL-IL-37b.Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products

2.2 重组表达载体在细胞中的表达

2.2.1 Western blot检测转染后细胞中IL-37b蛋白的表达

如图2所示，给予LPS刺激后，转染的RAW 264.7细胞裂解液的Western blot结果显示，有两条特异性的蛋白条带，位置分别在25 kDa与15 kDa附近，分别为FL-IL-37b与M-IL-37b，条带大小与预期结果相符[8,13]。证实转染后的RAW 264.7细胞中有M-IL-37b与FL-IL-37b的表达。

图2 转染的RAW 264.7细胞中IL-37b的表达Fig.2 Expression of IL-37b protein in the transfected RAW 264.7 cells

2.2.2 共聚焦显微镜检测转染后细胞中IL-37b的表达与定位

如图3所示，绿色为融合了绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的IL-37b，蓝色为DAPI染色的细胞核。转染后，M-IL-37b主要在细胞核中表达，FL-IL-37b则在细胞质、细胞核中都有表达；LPS能够在一定程度上诱导IL-37b表达上调。

图3 带GFP标签的IL-37b在RAW 264.7细胞中的表达Fig.3 Expression of IL-37b with GFP tag in the transfected RAW 264.7 cells

2.3 Real time-PCR检测转染后的RAW 264.7细胞对于LPS刺激的抑制作用

如图4所示，real-time PCR结果显示转染pEGFP N1/IL-37b质粒的RAW 264.7细胞对于LPS刺激引起的促炎性细胞因子IL-6的表达有抑制作用，与转染空质粒载体的对照组相比差异显著，并且FL-IL-37b对于IL-6的抑制作用稍强于M-IL-37b。证实转染的IL-37b能够稳定表达并在细胞内发挥炎症抑制作用。

注：与LPS组比较，*P<0.05，**P<0.01。图4 LPS刺激转染的RAW 264.7细胞中IL-6的表达(n=3)Note.Compared with the LPS group，*P<0.05；**P<0.01.Fig.4 Expression of IL-6 mRNA in the transfected RAW 264.7 cells stimulated by LPS

3 讨论

Bulau等[7]研究发现，IL-37b的1号外显子能够编码caspase-1酶切位点，IL-37b前体分子需要caspase-1切割修饰才能成为成熟分子移入细胞核参与转录调控；突变导致caspase-1失活后，IL-37b不能进入细胞核，并且对炎症反应的抑制作用降低。成熟形式的IL-37b进入细胞核后，能够与Smad 3 (mothers against decapentaplegic homolog 3)结合形成功能性复合物影响基因转录，并抑制Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)诱导表达促炎症性细胞因子，从而抑制树突状细胞的活化以及相应的免疫应答反应[8,14]。成熟形式的IL-37b的向细胞外分泌同样需要caspase-1的作用，但LPS诱导的巨噬细胞分泌IL-37b前体分子的过程不依赖caspase-1[7,14]。用相应的中和抗体中和IL-37b转基因小鼠体内的IL-37b，并注射LPS诱导感染性休克，小鼠血清中IL-6的表达显著升高，表明IL-37b的作用受到抗体拮抗，因而证实IL-37b能够分泌到细胞外发挥作用，说明其在细胞内外环境中具有双向功能[7]。

同为IL-1家族细胞因子的IL-18与其受体IL-18R结合形成的复合物能够诱导IFN-γ表达。IL-37b与IL-18有很高的同源序列，无论是全长还是成熟形式的IL-37b都能够与IL-18R的α链产生结合，且成熟形式IL-37b的结合能力较全长形式更强。但IL-18与IL-18Rα的结合能力比IL-37b成熟分子更强，因此IL-37b不能拮抗IL-18的功能。IL-18BP(IL-18 binding protein)是IL-18的天然抑制剂，能够抑制IL-18与IL-18R的结合；成熟形式的IL-37b可以与IL-18BP结合，增强IL-18BP对IL-18信号转导的抑制，从而抑制IFN-γ的表达[15-16]。近年来也有研究显示IL-37b发挥作用需要IL-1家族细胞因子受体IL-1R8参与，IL-1R8可能与IL-18Rα一样作为IL-37b的受体参与免疫应答。此外，IL-37b还能够通过抑制STAT1-4、c-Jun、p38 MARK、ERK等信号分子的磷酸化来调控促炎信号的传导[17]。

本实验中构建的真核表达载体pEGFP N1/IL-37b含有SV40和CMV启动子及GFP标签，能够稳定表达外源基因并有利于检测基因的转染效率。同时，GFP有利于检测全长与成熟形式的IL-37b在不同细胞器中的定位。实验中采用的RAW 264.7细胞系小鼠来源的单核巨噬细胞，自身并无IL-37表达，能够排除以人源细胞系作为研究对象产生的背景干扰。LPS在体内与体外都能够诱导大量促炎性细胞因子的表达[8]，同时，在LPS刺激细胞后，IL-37b mRNA和蛋白的表达水平上调，表明LPS能够使IL-37b mRNA趋于稳定[16]。Western blot与共聚焦显微镜观测结果显示构建的FL-IL-37b与M-IL-37b的真核表达载体转染后经LPS诱导均可表达FL-IL-37b与M-IL-37b，其中M-IL-37b主要在定位于细胞核中，FL-IL-37b则在细胞质、细胞核中都有表达。Real-time PCR结果显示转染后的细胞中LPS诱导的IL-6的表达降低，表明转染后FL-IL-37b与M-IL-37b能够在细胞中发挥炎症抑制作用。上述结果与已报导的文献中的数据相符，证实构建的pEGFP N1/IL-37b能够稳定的表达相应的IL-37b，为进一步研究IL-37b在炎症反应中的发挥的作用及其细胞内外机制提供了便利。

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