三氮脒含量测定的高效液相色谱法研究

林仙军， 周芷锦， 罗成江， 王彬，陈晓林

(浙江省兽药饲料监察所，杭州 311101)

三氮脒为兽医专用抗原虫药[1]，别名贝尔尼、血虫净，为重氮胺苯眯乙酞甘氨酸盐水合物，对家畜的锥虫、梨形虫及边虫均有作用[2-4]，用药后血药浓度高，维持时间短，治疗效果好，预防效果差[5]。三氮脒对家畜的毒性较大[6]，安全范围较小，可引起副交感神经兴奋样反应，过量使用可引起死亡[7]。三氮脒的质量标准收载于《中华人民共和国兽药典》2015年版一部[8]，采用永定滴定法测定含量，专属性较差，对于符合规定的样品能够准确检测，但对于不纯的样品往往无法准确测定，滴定时不能显示终点无法检测或者终点显示不准确。对三氮脒的研究主要有残留检测[9-10]和有关物质[11]，但未见高效液相色谱法测定三氮脒含量的报道。因此，研究高效液相色谱法测定三氮脒的含量，对完善兽药质量标准有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 仪器设备 Agilent 1260高效液相色谱仪，配DAD检测器(美国Agilent公司)；AG-285电子天平(Mettler公司)；SL502N电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；METTLER TOLEDO 320酸度计(Mettler公司)；METTLER TOLEDO T50全自动滴定仪(Mettler公司)。

1.2 试剂与药品 乙腈、甲醇均为色谱纯，德国默克公司；磷酸、三乙胺、盐酸、过氧化氢和氢氧化钠均为分析纯；水为超纯水。三氮脒对照品来源为Dr.Ehrenstorfer GmbH，批号G125952，含量88.9%。注射用三氮脒来源为成都中牧生物药业有限公司，批号为20150901,20150902,20150903，规格为1 g；A企业，批号为160401，规格为1 g。

1.3 对照品溶液和供试品溶液的配制 分别取三氮脒对照品和供试品适量，精密称定，用5%乙腈溶液超声溶解并定量稀释制成每1 mL中约含20 μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。

1.4 标准曲线系列溶液的配制 取三氮脒对照品适量，用5%乙腈溶液超声溶解并稀释制成每1 mL中含三氮脒100 μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液。取对照品溶液适量，用5%乙腈溶液稀释成浓度分别为1、2、5、10、20、50和100 μg/mL的溶液。

1.5 高效液相色谱条件和系统适应性试验 色谱柱：Agilent Zorbax XDB C18内径4.6 mm，柱长250 mm，粒径5 μm；检测波长：370 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；流动相为0.05 mol/L磷酸溶液(用三乙胺调节pH值至3.0)-乙腈(95∶5,V/V)。

1.6 永停法滴定的方法 取本品1 g,精密称定，加水20 mL使溶解，加盐酸溶液(1→2)40 mL，搅拌使溶解，再加溴化钾2 g，用亚硝酸钠滴定液(0.1 mol/L)迅速滴定。每1 mL亚硝酸钠滴定液(0.1 mol/L)相当于51.55 mg的C14H15N7·2C4H7NO3。

2 结果与分析

2.1 标准曲线及线性关系考察 取1.4项下溶液，按照建立的色谱条件进样检测，得到三氮脒对照品溶液色谱图见图1。以系列对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，三氮脒在1～100 μg/mL浓度范围内线性关系良好，线性方程Y=102.12X-1.4706，相关系数r=0.9998，标准曲线图见图2。

图1 三氮脒对照品溶液(1.三氮脒)Fig 1 Diminazene reference solution (1.diminazene)

图2 三氮脒标准曲线图Fig 2 Diminazene standard chart

2.2 稳定性试验 取批号为20150901的三氮脒供试品溶液，分别于0、2、4、6、12和24 h进行测定，测得三氮脒峰面积分别为2048.15645、2046.13654、2041.56871、2032.56225、2010.11236和2035.66785，表明供试品溶液稳定性良好。

2.3 HPLC法和永停法比较 分别用HPLC法和永停法对实际样品进行测定，数据见表1。对成都中牧生物药业有限公司提供的注射用三氮脒进行检测，批号为20150901,20150902,20150903，三氮脒的含量与永停法一致，相对偏差在0.5%以内。同时对A企业产品，批号为160401，规格为1 g的注射用三氮脒进行了含量测定，HPLC法测定结果为18.4%，峰形良好没有干扰。而永停法无法显示终点，含量无法测定。根据后续初步研究，判断该注射用三氮脒中含有大量多西环素，怀疑多西环素对永停法测定三氮脒产生干扰，导致无法测定的现象发生。

表1 HPLC法与永停法测定含量结果比较(n=3)Tab 1 Comparison of content determination by HPLC method and permanent stop method(n=3)

3 讨论和小结

取标准曲线系列溶液中20 μg/mL对照品溶液，在200-400 nm波长范围内进行DAD扫描。结果三氮脒在370 nm的波长处有最大吸收，见图3。因此，选择370 nm作为检测波长。

图3 三氮脒DAD扫描图谱Fig 3 Diminazene DAD scanning pattern

用乙腈-水作为流动相时，三氮脒色谱峰拖尾较为严重。在流动相中加入三乙胺、磷酸等改进剂能够抑制解离，改善峰形。研究考察了0.01、0.025和0.05 mol/L等不同浓度的磷酸溶液，添加三乙胺调节pH值为2.0、2.5、3.0和3.5。结果磷酸浓度低，峰形拖尾较严重，磷酸浓度提高，色谱峰拖尾得到改善；pH值对色谱峰影响较小，和金录胜[11]的研究一致；考察了乙腈的比例对保留时间的影响，乙腈的量5%的时候，保留时间约为10.6分钟，比较合适。

三氮脒为黄色或橙黄色结晶性粉末，无臭，遇光、遇热外观变为橙红色，但含量保持不变。对三氮脒的稳定性进行了研究，取三氮脒0.1 g，分别加1 mol/L盐酸溶液、1 mol/L氢氧化钠溶液和5%过氧化氢溶液各1 mL，放置1 h，依法测定。结果三氮脒在1 mol/L盐酸溶液中的放置1 h后，溶液无色，含量下降明显，90%以上已降解；在氢氧化钠溶液和过氧化氢溶液中溶液颜色橙红色，含量稳定。其降解产生的杂质均不干扰三氮脒色谱峰。

对含量较低或者存在非法添加物干扰的注射用三氮脒，永停滴定法多数无法准确测定其含量，而高效液相色谱法具有良好的专属性，能够准确测定三氮脒的含量，具有明显的优势。因此，建立的方法可用于三氮脒的质量控制。

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