重组禽流感病毒H5亚型Re-7株在MDCK细胞上增殖条件的研究

陈宏，王博，赵海源*，李金祥，赵博，李莉,王玉红，崔凯，朱长动

(1.吉林冠界生物技术有限公司，吉林梅河口 135000；2. 中国农业科学院，北京 100081)

在禽流感病毒中，部分H5和H7亚型毒株可引起高致病性禽流感。我国是世界上禽类养殖量最大的国家，也是高致病性禽流感的爆发区，2015年中国大陆10个省发生16起H5高致病性禽流感疫情，造成的直接经济损失高达数十亿元[1]。这就需要大量安全、高效、低成本的禽流感疫苗。目前市场上大部分疫苗仍为鸡胚制备[2]，这种疫苗生产需要消耗大量的SPF鸡胚，且劳动强度大、产量不稳定，不利于应对大规模的禽流感疫情爆发。与传统鸡胚生产方法相比，动物细胞培养生产禽流感疫苗具有很多优势，如抗原匹配性好，可以进行大规模生产和缩短生产周期，自动化控制程度高，批间差异小等。通过我们的研究证明，禽流感病毒在MDCK传代细胞上具有良好的适应性，用其培养的禽流感病毒获得的病毒滴度较高。试验对H5亚型Re-7株病毒在MDCK细胞中的增殖条件进行探索，以期筛选出最适接毒量和最佳收获时间，为动物细胞生产禽流感疫苗提供了相对稳定的参数指标。

1 材料与方法

1.1 细胞和病毒 MDCK悬浮细胞系是由吉林冠界生物技术公司自行驯化；重组禽流感病毒H5亚型Re-7株购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

1.2 主要试剂及耗材 选用培养基为国产无血清全悬浮细胞培养基；1%鸡红细胞悬液由吉林冠界生物技术公司自行制备；检验用SPF鸡胚购自梅里亚公司。

1.3 方法

1.3.1 最适接毒量MOI以及最佳收毒时间的确定

将重组禽流感病毒H5亚型Re-7株种毒以不同的MOI(10-3、10-2、10-1)分别接种于3台100 L生物反应器(分别命名为1#、2#、3#反应器)相同数量的细胞中，从接毒后的24 h开始，每隔12 h取样测其毒价(HA滴度、TCID50以及EID50)直至收毒并测其毒价(HA滴度、TCID50以及EID50)。

1.3.2 禽流感病毒在反应器中的接种及增殖过程

接种前将3台100 L反应器的细胞密度都控制在4×106cells/mL左右，细胞活力控制在95%左右，然后通过无菌的方法将MOI为10-3、10-2、10-1的种毒分别接种至1#、2#、3#反应器的细胞悬液中。从接毒后24 h开始，每隔12 h取样监测活细胞数以及细胞活率，并使用显微镜观察细胞病变情况。

2 结 果

2.1 最适接毒量MOI以及最佳收获时间

2.1.1 不同的感染复数(最适接毒量)对病毒增殖的影响 当种毒接入量MOI为10-3时，由于病毒感染量低而使增殖速度降低，无法达到较高的血凝价和毒价。当种毒接入量MOI为10-1时，由于病毒的感染量过高而使感染过快，造成细胞在感染的初期过早的死亡，此时也无法获得较高的血凝价和毒价。而当种毒接入量MOI为10-2时病毒的增殖比较稳定，病毒的血凝价和毒价较高，血凝价最高值为1∶1024[3]，每1 mL病毒含量最高达到107.33TCID50，每0.1 mL病毒含量最高达到106.83EID50[4]，结果见表1。

2.2.2 最佳收获时间的确定 通过对不同感染复数对病毒增殖的研究，确定最适接毒量MOI为10-2，在此接毒量的条件下对最佳收获时间进行试验分析，当接毒后60 h血凝价达到1∶1024，每1 mL病毒含量最高达到107.33TCID50，每0.1 mL病毒含量最高达到106.83EID50，并且在接毒后72 h毒价稳定在此水平无明显变化，说明在接毒后60 h为最佳收获时间，结果见图1。

表1 不同的MOI对病毒增殖的影响(HA、TCID50/mL；EID50/0.1mL)Tab 1 Effects of different MOI on viral proliferation(HA、TCID50/mL, EID50/0.1mL)

图1 最佳收获时间曲线Fig 1 The best harvest time curve

2.2 禽流感病毒在反应器中的接种及增殖过程

2.2.1 接毒后的活细胞数以及细胞活力 接毒后随着时间的推移，病毒的感染逐步增强，活细胞数会随之减少，细胞活率逐渐下降。当种毒接入量MOI为10-3时，由于病毒感染量低细胞活率下降较慢，病毒的增殖会受影响。当种毒接入量MOI为10-1时，由于病毒的感染量过高而使感染过快造成细胞快速死亡，细胞活率下降较快，病毒的增殖也会受到影响。而当种毒接入量MOI为10-2时病毒的增殖比较稳定，细胞活率下降的趋势也较为正常，后期收毒时也能保持较高的毒价[5]，结果见表2。

表2 不同接毒量对接毒后的活细胞数和细胞活力的影响(cells/mL；%)Tab 2 Effects of the number of living cells and cell viability of different venomous antivirus (cells/mL, %)

2.2.2 接毒后病毒的增殖以及在细胞上的病变情况 当种毒接入量MOI为10-2时病毒的增殖比较稳定，细胞活率下降的趋势也较为正常，通过接毒后取样镜检观察细胞病变情况可以看出，24 h细胞病变开始出现，有部分细胞表面变得粗糙并伴有裂痕。48 h病变十分明显，部分细胞破裂，说明此时病毒出芽释放比较明显。72 h细胞破碎严重，病毒出芽释放相对完全。结合接毒后48 h～72 h的测毒情况，设定在接毒后60 h的收获时间是合理的[6]，结果见图2。

A. 健康细胞(400×)A. healthy cells (400×)

B. 24h细胞病变(400×)B. 24h cell lesion (400×)

C. 48h细胞病变(200×)C. 48h cell lesion (200×)

D. 72h细胞病变(200×)D. 72h cell lesion (200×)

3 讨 论

利用动物传代细胞生产禽流感疫苗与使用鸡胚苗相比，在产量及疫苗的稳定性上都有较为明显的优势，也在很大程度上降低了由于流感病毒在鸡胚上连续传代而引起HA基因发生突变的几率[7]，使免疫效果更为可靠。随着MDCK细胞生产禽流感疫苗推向市场，此疫苗的可靠性也在全国范围内得到了更多的认可。

本试验中重组禽流感病毒H5亚型Re-7株接种MDCK细胞，选取了三种不同的接毒量并在接毒后不同时间取样监测毒价，从而最终确定最适接毒量和最佳收毒时间。在病毒感染复数MOI为10-2时收获时毒价最高，适当的病毒接种量可以更好的实现病毒的增殖[8]。当接种量过低和细胞数量不匹配，病毒需要经过多次循环复制，达到血凝滴度的峰值的时间延长，病毒生产过程减慢，最终的毒价也不高[9]。当病毒接种量过多时，细胞在病毒的感染下很快死亡，同时会产生大量不具有感染性的不完全病毒颗粒，限制病毒的多循环感染[10]。

收毒时间对于病毒培养过程来说也是一个关键性的参数，试验在确定接毒量的同时对于收毒时间也进行了研究，在接毒后60 h毒价达到峰值，并且在接毒后72 h毒价仍稳定在此峰值水平，没有明显的升高或降低，出于对整个工艺流程中时间成本的考虑，收获的最佳时间应为接毒后60 h左右。

利用生物反应器培养动物细胞进行禽流感疫苗生产的技术已日趋成熟，此种技术在国内外动保行业正在被广泛推广[11]。目前我们的生物反应器规模化培养技术水平已经达到能够放大至6000 L自动控制的规模。试验对重组禽流感病毒H5亚型Re-7株的最适接毒量和最佳收毒时间进行了研究，确定最适接毒量MOI为10-2、最佳收获时间为60 h，在100 L生物反应器中重复验证，获得稳定的试验结果，病毒血凝价达到1∶1024，每1 mL病毒含量达到107.33TCID50，每0.1 mL病毒含量达到106.83EID50。研究为禽流感疫苗的生物反应器的规模化生产提供了可靠的理论依据。

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