桉油溶液剂的急性毒性和安全药理学研究

阳刚，殷中琼，魏琴，周黎军，杨仕群

(1.宜宾职业技术学院生物与化工工程系，四川宜宾 644003；2.四川农业大学动物医学院天然药物研究中心，成都 611130；3.宜宾学院生命科学与食品工程学院，四川宜宾 644000)

桉油是从桃金娘科植物蓝桉、樟科植物樟或上述两种同属其他植物经水蒸气蒸馏的方法萃取得到的一种挥发油[1]。研究表明，桉油具有抗菌、镇痛抗炎以及良好的透皮渗透作用[2-3]。除此以外，桉油对蠕形螨、蛛形螨、滴虫和竹斑蛾幼虫有较强的杀灭和防治作用[4-5]，常作为皮肤渗透增强剂、鼻血管收缩剂，镇咳剂、空气消毒剂、杀菌防臭剂、驱蚊蝇剂等。随着人们对药物残留、食品安全性、环境污染等问题的日益重视，研制高效、低毒、安全的天然抗菌、抗寄生虫药物用来替代化学类药物具有十分重要的意义。前人研究发现桉油的主要成分1，8-桉油素具有改善豚鼠哮喘，增强补骨脂素体外抗肿瘤活性的作用[6-7]，但目前尚未见桉油溶液剂的急性毒性和安全药理学研究报道。本研究通过桉油溶液剂对大鼠的急性毒性、神经系统、血管系统及呼吸系统的影响来初步评价该药的安全性和毒性，以期为进一步进行临床试验和临床应用提供药理毒理依据。

1 材料与方法

1.1 药物试剂及仪器 桉油(江西福达香料化工有限公司)，溶剂(药典级，CAS号：9005-65-6)。桉油溶液剂，由桉油加溶剂制备而成。电子天平(宁波群安仪器有限公司)、多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂)、多功能大鼠自主活动记录仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)、BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟软件有限公司)。

1.2 动物 健康大鼠(生产许可证号：SCXK(川)2008-24)，体重(200±20)g，雌雄各半，由四川农业大学实验动物中心提供。

1.3 桉油溶液剂急性毒性实验 将健康大鼠随机分为3组，每组4只，雌雄各半。以5742 mg/kg为最高剂量组，再以3倍递减设置若干组，依次进行试验，找出4/4致死量和0/4致死量，以确定LDn (最低致死剂量)和LDm (最高致死剂量)。

参考兽药研究技术指导原则汇编和急性毒性试验[8-10]，将大鼠随机分成5组，每组10只，雌雄各半，设5个剂量组：2772、3267、3960、4752、5742 mg/kg。对各剂量组进行一次性经口灌胃给药，给药后观察并记录大鼠的摄食、饮水、呼吸、活动和死亡情况，连续观察7 d，若4 d后仍有动物死亡，则观察14 d。用改良寇氏法计算桉油溶液剂的LD50和95%可信区间。对试验期间死亡的和观察期满处死的大鼠进行剖检，若发现异常组织或脏器，作病理组织学镜检。

1.4 桉油溶液剂安全性药理实验

1.4.1 动物分组及给药方法 大鼠按体重随机分成5组，包括低剂量组、中剂量组、高剂量组、赋形剂组和空白对照组，每组10只，雌雄各半。高剂量(30%)、中剂量(18%)、低剂量(6%)组和赋形剂组分别按0.3 mL/只涂抹桉油溶液剂和赋形剂，对照组涂抹等剂量生理盐水[4]。连续给药5 d，其中低剂量为治疗剂量。

1.4.2 桉油溶液剂对大鼠中枢神经系统的影响 最后一天给药后4 h内，分别密切观察记录各组大鼠的一般行为表现、姿势、瞳孔变化及步态等，记录是否有流涎、肌颤等情况[8-9]。给药后7 d内每日观察大鼠情况。如出现明显的中枢兴奋、抑制或其他中枢系统反应时，进行相应的体内或体外试验的进一步研究。

通过以下实验评价药物对中枢神经系统的影响。自主活动：最后一次给药0.5 h后，采用多功能大鼠自主活动记录仪，观察和记录大鼠的自主活动情况。爬杆试验：最后一次给药后0.5 h后，进行大鼠的爬杆试验，将光滑金属棒垂直竖立，基部固定，将大鼠置于金属棒顶端，头朝下让其自然向下爬行，每只大鼠按以下标准进行评级。0级：一步一步向下爬；1级：向下滑行；2级：不能抓住棒；3级：翻正反射消失。

1.4.3 桉油溶液剂对大鼠心血管系统的影响 分别于给药前、给药结束次日和给药结束一周末，测定并记录各组大鼠的心率情况[8-9]。治疗剂量出现明显的心率、节律异常时，应进行相应的体内或体外试验的进一步研究。心率的测定方法：大鼠用戊巴比妥钠按50 mg/kg的剂量腹腔注射麻醉，待其麻醉后，使用BL-420F记录心电图，心率。

1.4.4 桉油溶液剂对大鼠呼吸系统的影响 分别于给药前、给药结束次日和给药结束一周末，测定并记录各组大鼠呼吸频率，并观察比较其呼吸节律和呼吸深度等[8-9]。治疗剂量出现明显的呼吸兴奋或抑制时，应进行相应的体内或体外试验的进一步研究。呼吸频率的测定方法是，大鼠用戊巴比妥钠按50 mg/kg的剂量腹腔注射麻醉，待其麻醉后，使用BL-420F记录大鼠呼吸频率。

2 结果与分析

2.1 桉油溶液剂急性毒性实验 各剂量给药组大白鼠的临床表现、大体剖检结果及心、肝、肺、肾、胃和肠的器官组织观察结果表明：低剂量组无明显变化，高剂量时造成胃鼓气或者胃内容物不消化，有桉油水乳剂残留现象，其他脏器无肉眼可见病变。死亡情况见表1。

表1 桉油溶液剂对大鼠经口急性毒性试验结果Tab 1 Effects of eucalyptus oil solution in acute oral toxicity test in rats

大鼠(每组10只)灌胃2772、3267、3960、4752、5742 mg/kg的桉油溶液剂后观察7 d

Rats were given 2772 mg/kg、3267 mg/kg、3960 mg/kg、4752 mg/kg、5742 mg/kg doses of eucalyptus oil solution by intragastric administration with a 7-day medical observation.n=10

由表1可知 i=lgdn-lgdn-1=lgd5-lgd4=3.7591-3.6769=0.0822，将表中数据代入改良寇氏法公式进行计算，LD50=lg-1[Xm-i(∑p-0.5)]=lg-1[3.7591-0.0822(2.7-0.5)]=lg-1(3.57826)=3811.5 mg/kg，标准误差 Sx50=i×[(∑p-∑P2)/n-1]1/2=0.0822×[(2.7-1.91)/9]1/2=0.024，LD50的95%可信限= lg-1(X50±1.96 Sx50)=lg-1(lg3811.5±1.96×0.024)，X50=lgLD50，lg-1(2.548)=3326.4 mg/kg，lg-1(4.259)=4306.5 mg/kg，可以得出 LD50为3811.5 mg/kg±0.047 mg/kg，95%置信区间3326.4 ～4306.5 mg/kg。

2.2 桉油溶液剂安全性药理实验

2.2.1 桉油溶液剂大鼠中枢神经系统的影响 在为期2周的试验过程中，3个受试药物组和赋形剂组大鼠的行为表现、姿势、步态以及瞳孔变化在整个试验过程中均未见异常，也未见流涎、肌颤等异样。用药组和爬杆实验中均一步一步向下爬，评价为0级。赋形剂组大鼠的活动灵活自如，与对照组无明显差异，被毛的光亮度肉眼观察与对照组也无差异。表明桉油溶液剂对大鼠的中枢系统无明显不良影响。

2.2.2 桉油溶液剂大鼠心率的影响 通过测定给药前后各组大鼠的心率发现，高、中、低、赋形剂和空白对照5个组在给药前、给药结束次日以及给药后1周末大鼠的心率与同期对照组间均无明显差异(P>0.05)，且同组内不同时间点之间也无显著差异(P>0.05)。初步表明桉油溶液剂对大鼠的心血管系统无明显不良影响，结果见表2。给药前后各剂量组大鼠的心电图见图1～图10，由图可知，桉油溶液剂各剂量对大鼠的心率无影响。

表2 大鼠不同时间的心率Tab 2 The heart rates in rats in different time

与空白对照组相比，*P<0.05差异显著,**P<0.01差异极显著，n=10

*P<0.05,**P<0.01, compared with normal control group

图1 给药前空白组大鼠心电图Fig 1 Electrocardiograms in normal control group before treatment

图2 给药后空白组大鼠心电图Fig 2 Electrocardiograms in normal control group at the day after treatment

图3 给药前赋形剂组大鼠心电图Fig 3 Electrocardiograms in vehicle control group before treatment

图4 给药后赋形剂组大鼠心电图Fig 4 Electrocardiograms in vehicle control group at the day after treatment

图5 给药前低剂量桉油溶液剂组(6%)大鼠心电图Fig 5 Electrocardiograms with low dose group of eucalyptus oil solution(6%)before treatment

图6 给药后低剂量桉油溶液剂组(6%)大鼠心电图Fig 6 Electrocardiograms with low dose group of eucalyptus oil solution(6%)at the day after treatment

图7 给药前中剂量桉油溶液剂组(18%)大鼠心电图Fig 7 Electrocardiograms with middle dose group of eucalyptus oil solution(18%)before treatment

图8 给药后中剂量桉油溶液剂组(18%)大鼠心电图Fig 8 Electrocardiograms with middle dose group of eucalyptus oil solution(18%)at the day after treatment

图9 给药前高剂量桉油溶液剂组(30%)大鼠心电图Fig 9 Electrocardiograms with high dose group of eucalyptus oil solution(30%)before treatment

图10 给药后高剂量桉油溶液剂组(30%)大鼠心电图Fig 10 Electrocardiograms with high dose group of eucalyptus oil solution(30%)at the day after treatment

2.2.3 桉油溶液剂大鼠呼吸系统的影响 通过测定给药前后各组大鼠的呼吸频率发现，高、中、低、赋形剂和空白对照5个给组在给药前、给药结束次日以及给药后1周末，大鼠的呼吸频率与同期对照

组间均无明显差异(P>0.05)，且同组内不同时间点间也无显著差异(P>0.05)。表明桉油溶液剂对大鼠的呼吸系统无明显不良影响，结果见表3。

表3 大鼠不同时间的呼吸频率Tab 3 The breathing rates in rats in different time

与空白对照组相比，*P<0.05差异显著, **P<0.01差异极显著，n=10

*P<0.05, **P<0.01, compared with normal control group.

3 讨论与小结

桉油的有效成分主要以1，8-桉油素为主， 用于治疗感冒、细菌性痢疾、肠炎及寄生虫病，但目前， 桉油在用于动物疾病的防治方面的研究较少[11]。为了制备稳定、低毒、方便的桉油制剂，筛选适宜溶剂，成功制备桉油溶液剂，对桉油溶液剂的急性毒性和安全药理学进行了试验。急性毒性试验是药物毒理学安全性评价的第一步，具有了解受试物急性毒性强弱的作用[12]。LD50是检测物质急性毒性的经典指标，稳定性好，敏感度高[13]。在大鼠口服急性毒性试验中，按照改良寇氏法计算出LD50为3811.5 mg/kg；余永莉等[14]研究结果表明，桉叶油小鼠口服给药LD50为1824.01 mg/kg，对比二者LD50，可发现桉油溶液剂的半数致死量约为桉叶油的两倍，考虑桉油溶液剂和桉叶油有效药物浓度不同，说明桉油溶液剂与桉叶油比较毒性未明显增强。根据急性毒性分级标准判断[15]，桉油溶液剂口服给药属低毒性药物。

安全性药理学评价是指主要药效作用以外广泛药理作用研究，尤其是观察药物对呼吸和神经系统的影响，补充毒性试验观察的不足，为全面了解药物的毒性提供基础，为临床提供更多的信息[16]。因此，安全性药理学评价有助于发现药物不良反应，也有助于发现药物的新用途和作用机制[17]。本试验按照兽用中药、天然药物安全药理学研究技术指导原则，首次通过无创的方式测定了桉油溶液剂对有维持生命作用的三大重要系统的影响。

观察桉油溶液剂对中枢神经系统的影响，可有多种检测项目，如动物的自主活动、爬杆试验等[18]。朱海等[19]在研究欧前胡素时，检测了小鼠的自发活动、爬杆能力，并进行了小鼠阈下剂量戊巴比妥钠催眠协同实验，发现此药单次ig对小鼠神经系统无明显影响。车爱萍等[20]研究表明，HR0905药物可使小鼠爬杆能力显著下降，自发活动有下降趋势，结果显示该药物存在中枢抑制性作用，这也说明对动物进行自主活动观察及爬杆试验检测，即可反映出药物对动物中枢神经系统的影响。本试验也采取了这两种检测方法，实验结果显示大鼠给药后活动自如，爬杆试验中也表现为一步一步向下爬，说明桉油溶液剂对大鼠的中枢神经系统无影响。

对于心血管系统的检测，心电图和心率等均是可靠而有价值的观察指标，心电图异常可反映心血管系统发生不良反应，具有重要的临床指导意义[18]。朱梅等[21]在研究中药藤菔降压片一般药理学作用时，试验结果表明其对麻醉大鼠心率、Q-T间期、P-R间期和QRS波群时间等均无明显影响。由于麻醉程度、保定体位及测量时间不同等，均可引起心电图的变化[18]，所以本试验在尽量减少外界条件对结果造成影响的情况下，测量出给药组和对照组各阶段的心电图虽有微小的差异，但均为正常大鼠心电图。且各给药组大鼠的心率变化与对照组亦无明显差异，说明桉油溶液剂对大鼠心血管系统无影响。

对于呼吸系统的检测，一般检测大鼠的呼吸频率变化[18]。本试验用BL-420多道生理信号采集系统，通过大鼠肌张力的强弱来测量大鼠的呼吸频率。实验结果表明桉油溶液剂对大鼠呼吸系统无明显影响。以上试验对桉油溶液剂急性毒性和安全药理学进行了综合评价， 为进一步进行临床治疗试验提供了药理毒理学基本依据。

桉油系中国药典(2000年版)法定药材[22]。桉油在医学、 兽医临床均具有应用基础。丁孝良等[23]研究表明，桉油β -环糊精包合物具有一定的抗炎镇痛作用，可促进软骨基质合成并抑制其分解，其作用机理可能与抑制iNOS的表达，降低NO含量有关。王文婷等[24]研究表明，桉油可提高光动力疗法治疗尖锐湿疣的疗效，这是因为桉油具有促渗作用，可渗入药物透皮吸收的限速层-角质层，降低细胞间脂质排列的有序性，增加流动性，从而促进药物透过皮肤。目前关于桉油药理毒理基础的系统性研究鲜有资料报道，因此，在开发桉油相关制剂的同时，应加强桉油药理毒理学基础研究，从而为临床应用提供更为全面的科学依据。

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