黄芪药渣中多糖的酶法制备及其抗氧化活性

龙良鲲，寒子纯，林群英，秦秀雯，赵浩源，丁少军

(1.南京林业大学化学工程学院，江苏南京 210037；2.南京野生植物综合利用研究院，江苏南京 210042)

黄芪属豆科植物，分为蒙古黄芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao]和膜荚黄芪[Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.]，以干燥根入药[1]。黄芪的主要药用成分为黄芪多糖、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷和黄酮等[2]。黄芪多糖(Astragaluspolysaccharides，APS)可作为免疫增强剂或调节剂，促进抗体形成，同时还有抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗应激、抗氧化和降脂等功效[3-5]。工业上多采用水提醇沉法提取黄芪多糖，其工艺简单易操作，但提取率较低(在3.80%～9.78%之间)[6-8]。黄芪经水提法制备多糖后形成的药渣中仍含有多糖等活性物质，这些物质被纤维素等聚合物限制而不易溶出[9-10]。纤维素酶是可降解纤维素高聚物的一组酶系，在制备多糖等药用活性物质方面具有良好的应用前景[8，11]。本试验利用纤维素酶制备黄芪药渣中的多糖，通过单因素和正交试验优化酶解作用条件，并评价黄芪多糖的抗氧化活性，为进一步高效利用黄芪资源提供技术途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄芪，产地为甘肃省陇西县，购自安徽省亳州市中药材市场；里氏木霉(Trichodermareesei)D-86271，购自芬兰VTT技术中心；秀丽线虫(Caenorhabditiselegans)，由笔者所在实验室保存。百草枯，购自Sigma公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)等生化试剂均为国产分析纯。

PDA培养基：200 g马铃薯，20 g葡萄糖，15 g琼脂粉，加蒸馏水至1 000 mL。

Mandels培养基：2.0 g KH2PO4，1.4 g(NH4)2SO4，0.3 g Urea，0.3 g MgSO4·7H2O，1.0 mL微量元素浓缩液(3.7 g/L CoCl2·6H2O，1.4 g/L ZnSO4·7H2O，1.6 g/L MnSO4·H2O，5.0 g/L FeSO4·7H2O)，10.0 g葡萄糖，0.3 g 酵母膏，加蒸馏水至1 000 mL。

固体发酵培养基：1.5 g小麦麸，1.5 g脱木素麦秆，5.0 mL 10×Mandels培养基。具体配制方法参考文献[12]。

1.2 试验方法

1.2.1 固态发酵制备纤维素酶 参照文献[12]中的方法进行固态发酵制备纤维素酶。取约108个里氏木霉孢子(PDA平板培养获得)接种于100 mL Mandels培养基，并于28 ℃、200 r/min 振荡培养2 d。将1 mL菌丝培养物接入固态发酵培养基中，混匀后30 ℃培养13 d。发酵结束后，每瓶发酵物中加入30 mL无菌水(含0.1%吐温80)，置于25 ℃、120 r/min 条件下提取120 min。提取液经8 000 r/min、10 min 离心后取上清液。所得粗酶液加入终浓度为0.02%的三氮化钠，并置于4 ℃保存备用。

1.2.2 酶活性的测定 参照文献[12]中的方法分别测定发酵液中滤纸酶、内切型纤维素酶(CMC酶活)、β-葡萄糖苷酶及木聚糖酶的活性。酶活性测定均在50 mmol/L的柠檬酸缓冲液(pH值为4.8)中进行，各设3个重复。1个单位(U)滤纸酶、CMC酶或木聚糖酶分别定义为1 min催化相应底物生成1 μmol葡萄糖(滤纸酶和CMC酶)或木糖(木聚糖酶)的酶量；1个单位(U)的β-葡萄糖苷酶定义为1 min催化4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)生成1 μmol 4-硝基苯酚的酶量。

1.2.3 黄芪药渣的获得 黄芪经粉碎后，按固液质量比为 1 ∶10 加入蒸馏水，90 ℃、150 r/min水浴浸提2 h，5 000 r/min 离心10 min获得上清液，重复提取1次。所得上清液加3倍体积的99%乙醇溶液，充分混匀，4 ℃静置过夜，6 000 r/min、10 min离心，沉淀经60 ℃烘干，即得黄芪粗多糖。所得黄芪残渣烘干至恒质量，装袋密封备用。

1.2.4 酶法提取黄芪药渣中的多糖

1.2.4.1 单因素试验 称取1 g黄芪药渣装入50 mL离心管中，加入5 mL 0.05 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH值为4.8)，分别加入不同量(0～10 U)的纤维素酶(以滤纸酶活性计算)，加入无菌水使总体积为10 mL。经50 ℃酶解2 h后，反应物经80 ℃水浴提取4 h，离心法获得上清液并经醇沉法获得粗多糖。粗多糖经适当稀释后，以苯酚-硫酸比色法测定总糖含量，并以二硝基水杨酸(3，5-dinitrosalicylic acid，DNS)法测定寡糖含量，两者之差即为多糖含量[13]。同时，比较不同酶解温度(35～55 ℃)或酶解时间(1～8 h)对酶法制备黄芪多糖的影响。

1.2.4.2 正交优化试验 根据单因素试验结果，对纤维素酶用量、酶解时间和酶解温度进行正交设计(表1)，优化黄芪多糖提取的最佳酶解条件。

表1 L16(43)正交试验设计表

1.2.5 黄芪多糖的抗氧化活性

1.2.5.1 DPPH自由基清除测定 根据文献[14]进行DPPH自由基清除测定，分别配制不同浓度(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40 mg/mL)的黄芪多糖。向10 mL玻璃试管中依次加入1 mL各浓度黄芪多糖待测液和2 mL 0.6 mg/L DPPH，混匀，室温避光反应30 min，测定517 nm处的吸光度。以50%乙醇作为空白对照，每个处理重复3次，求平均值。DPPH清除率的计算公式如下：

SCDPPH=(1-DS517 nm/DC517 nm)×100%。

式中：SCDPPH为DPPH的清除率；DS517 nm为样品的吸光度；DC517 nm为对照的吸光度。

1.2.5.2 线虫抗氧化测定 通过添加百草枯诱导秀丽线虫产生氧化应激损伤以评价黄芪多糖的抗氧化活性。将黄芪多糖制成一定浓度的溶液后，添加至培养有秀丽线虫的96孔板中，于20 ℃培养48 h，再于每个孔里添加百草枯，使其终浓度为40 mmol/L。每24 h观察1次线虫存活情况并记录线虫存活数目，直至秀丽线虫全部死亡，每组试验所测秀丽线虫数目不少于80条。

2 结果与分析

2.1 纤维素酶的制备及酶活性测定

由图1可知，粗酶液中的滤纸酶、β-葡萄糖苷酶、CMC酶和木聚糖酶的活性分别为2.02、1.99、167.00、53.90 U/mL。可见，固态发酵液中含有较高水平的纤维素酶和半纤维素酶。

2.2 酶法制备黄芪药渣中多糖的影响因素

2.2.1 纤维素酶用量对黄芪多糖提取的影响 由图2可知，未经纤维素酶水解作用，从黄芪药渣中水提获得的多糖提取量为2.9 mg/g；纤维素酶用量为0.2 U/g时，多糖提取量达8.2 mg/g。增加纤维素酶的用量，多糖的提取量明显升高，纤维素酶用量为4.0 U/g时，多糖提取量达到最大值，为 34.7 mg/g。继续增加纤维素酶的用量，黄芪多糖的提取量无明显变化。因此，提取黄芪多糖的最佳纤维素酶用量为 4.0 U/g。酶解处理获得的多糖量最高可达未经纤维素酶处理组的11.97倍。

2.2.2 酶解温度对黄芪多糖提取的影响 酶解温度对酶法制备黄芪多糖的效率有明显的影响。由图3可知，低温(35 ℃)下，酶法提取黄芪多糖的提取量为27.9 mg/g。提高酶解温度，黄芪多糖的提取量明显增加，在45 ℃时，黄芪多糖的提取量达到最大值，为35.7 mg/g。继续升高温度，黄芪多糖的提取量明显降低。因此，利用纤维素酶提取黄芪药渣中黄芪多糖的最适温度为45 ℃。

2.2.3 酶解时间对黄芪多糖提取的影响 由图4可知，随着酶解时间的延长，黄芪多糖的提取量明显升高。酶解时间为4 h时，黄芪多糖的提取量达34.6 mg/g。进一步延长酶解时间，多糖提取量呈现下降的趋势。因此，酶解4 h为最佳的酶解时间。

2.3 正交优化试验

根据单因素试验的结果，继续对纤维素酶用量、酶解温度、酶解时间这3个因素进行正交设计优化以获得最佳的提取条件。正交试验结果如表2所示，各因素对黄芪多糖提取量的影响程度表现为酶解温度>纤维素酶用量>酶解时间。根据试验结果优化得最佳提取条件为酶解温度45 ℃、纤维素酶用量 4.0 U/g、 酶解时间4 h。最后经验证，在此条件下黄芪多糖的提取量为44.6 mg/g。

表2 酶法提取黄芪多糖的正交试验结果

2.4 黄芪多糖的抗氧化活性

由图5可知，随着黄芪多糖浓度的升高，其对DPPH自由基的清除率明显提高，当黄芪多糖浓度达到0.30 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除率可达25.4%。继续升高黄芪多糖的浓度，其对DPPH自由基的清除率则无明显增加。

由图6可知，0.30 mg/mL黄芪多糖能够明显提高线虫的存活率，最长存活时间为9 d，比空白对照组(CK)延长4 d。由图7可知，添加0.30 mg/mL黄芪多糖，秀丽线虫的平均寿命为3.48 d，比对照组(2.67 d)提高了30.3%。因此，黄芪多糖明显降低了百草枯对线虫引起的氧化损伤，其具有良好的抗氧化作用。

3 结论与讨论

水提醇沉工艺只能获取黄芪组织中部分多糖，残留的药渣中仍含有丰富的多糖等活性物质[9]，这部分物质由于受组织中纤维素等结构成分的限制而难以溶出。微生物等来源的纤维素酶能够有效作用于黄芪组织中的纤维结构，从而促进黄芪多糖的提取[8，11，15]。相对于碱法(如氧化钙水溶液)制备黄芪多糖，酶法制备具有条件温和、产物纯度高和绿色环保等优势。本试验以里氏木霉固态发酵获得了高活性的纤维素酶，以经2次高温水提处理的黄芪药渣作为材料提取多糖。结果显示，与未经酶处理的对照组相比，酶解处理使黄芪多糖的提取量提高了11.97倍。正交优化试验结果表明，酶法制备多糖中的主要影响因素影响由大到小依次为酶解温度、纤维素酶用量、酶解时间，而最佳酶解参数为酶解温度45 ℃、纤维素酶用量 4.0 U/g、酶解时间 4 h，在此条件下，从黄芪药渣中可获得 44.6 mg/g 黄芪多糖。由此可见，纤维素酶对促进黄芪药渣中多糖的制备具有重要的意义。同时，是否存在更加有效的黄芪组织水解酶系以进一步提高黄芪多糖的提取效率值得进一步研究。

抗氧化活性是黄芪多糖的重要生理功能[16]。本试验体外抗氧化试验结果表明，酶法制备的黄芪多糖对DPPH自由基的清除率为25.4%，低于文献报道值[14，17]。这可能与获得的黄芪多糖分子量或结构有一定的关系[18]。同时，以秀丽线虫为模型测试黄芪多糖的体内抗氧化能力，发现0.30 mg/mL黄芪多糖明显增强了秀丽线虫对百草枯的抗性，处理组线虫的平均寿命延长了30.3%。结果表明，纤维素酶法制备的黄芪多糖具有结构完整性，显示出良好的抗氧化活性。利用纤维素酶技术促进黄芪药渣中多糖的制备，对实现黄芪资源的高效利用具有重要意义。

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