猪流行性腹泻病毒变异株RT-PCR检测方法的建立

俞正玉，逄凤娇，孙 冰，徐向伟，茅爱华，郭容利，范宝超，杜露平，温立斌，倪艳秀，何孔旺，李 彬

(江苏省农业科学院兽医研究所/国家兽用生物制品工程技术研究中心/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，江苏南京 210014)

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diahorrea virus，PEDV)是引起猪呕吐、腹泻和脱水为主要临床症状特征的猪肠道传染病病原，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪等各年龄段均可发病，但哺乳仔猪中的感染率最高[1-2]。该病多发生在冬春寒冷季节，以12月至次年2月为高发季节[3]。

2010年冬季至2011年春季全国各地猪场的猪群中先后发生严重的传染性腹泻疾病，发病突然，传播较快，流行范围广，流行时间长，应用各种抗生素防治无效，发病率约80%，死亡率高达50%～85%，造成重大的经济损失[4-5]。经研究表明，猪流行性腹泻病毒变异株是此次疫情的元凶。变异株与原来毒株PEDV经典毒株CV777(AF353511.1)的基因组同源性在97%左右，变异最大的为S基因，同源性在94%以下，且存在氨基酸发生缺失和插入的序列特征。此前，我国尚无PEDV变异株的特异检测技术，目前的常规 RT-PCR 技术不能区分PEDV经典毒株和变异株[6-8]，只能依靠序列测定和分析来确诊，操作繁杂、耗时长、成本较高。因此，本试验根据猪流行性腹泻病毒变异株S基因发生核苷酸缺失和插入的特征，设计并合成检测引物，采用 RT-PCR方法扩增PEDV变异株的部分S基因，而不与PEDV经典毒株反应，从而特异、敏感、省时、省力地检测出PEDV变异株，为PEDV的检测提供工具，对防控猪流行性腹泻病具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 病毒株

猪流行性腹泻病毒变异株AH2012、猪流行性腹泻病毒经典株CV777、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪传染性胃肠炎(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)均由江苏省农业科学院兽医研究所分离并保存。

1.2 主要试剂与仪器

核酸(RNA/DNA)提取试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，RT-PCR Mix反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，dNTP、DL2000 DNA Marer、pMD18-T载体等购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 引物的设计和合成

根据猪流行性腹泻病毒变异株AH2012S基因的核苷酸序列，采用Primer 5.0设计引物，经过大量筛选得到如下引物序列：正向引物(PEDV-VF)序列为5′-TTGGTGAAAACCAGGGTGTC-3′，反向引物(PEDV-VR)序列为 5′-CAACACTATGTTCACTCA-3′。

1.4 病毒核酸的提取

按照核酸(RNA/DNA)提取试剂盒说明书进行病毒核酸的提取。

1.5 RT反应

在20 μL反应体系中加入4.75 μL DEPC处理水，6 μL总RNA，1 μL PEDV-VR(20 μmol/L)，1 μL dNTP(10 μmol/L)，混匀后于65 ℃保持5 min，迅速转移到冰上骤冷5 min；然后向反应管中加入2 μL DTT(0.1 mmol/L)、4 μL 5×反转录缓冲液、1 μLRNA酶抑制剂(40 U/μL)、0.25 μL反转录酶(200 U/μL)，42 ℃反应50 min；72 ℃ 15 min灭活反转录酶后获得反转录产物cDNA。

1.6 PCR扩增

在50.0 μL的反应体系中加入30.5 μL DEPC处理水、2.0 μL cDNA、2.0 μL PEDV-VF(20 μmol/L)、2.0 μL PEDV-VR(20 μmol/L)、5.0 μL 10×PCR缓冲液、8.0 μL dNTP(2.5 mmol/L)、0.5 μL DNA聚合酶(5 U/μL)。PCR的反应参数为94℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃延伸5min。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并观察结果。

1.7 特异性试验

以PEDV变异株、PEDV经典毒株、PRRSV、TGEV、PRV病毒RNA反转录成的cDNA为模板。取等量的模板进行PCR扩增，同时做阴性对照，观察琼脂糖凝胶电泳情况。

1.8 敏感性试验

在20 μL反转录体系中，加1 μL连续10倍稀释后的总RNA。按照本试验建立的方法，在PCR反应体系中加入2 μL的cDNA，进行PCR扩增，观察琼脂糖凝胶电泳情况。

1.9 重复性试验

用所建立的RT-PCR方法对6份不同的PEDV变异株阳性病料样品分别进行3次重复性试验，检测该方法的重复性和稳定性。

1.10 临床样品检测

2013年自华东多地猪场中采集腹泻发病猪肠道及粪便样品共318份，提取样品RNA，用本研究所建立的RT-PCR方法检测各份样品RNA中是否含有PEDV变异株核酸。检测中使用PEDV变异株作为阳性对照。

1.11 RT-PCR方法的可靠性检测

将PEDV变异株阳性的PCR产物进行克隆、测序，序列比对后验证PCR的可靠性。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR结果

以猪流行性腹泻病毒变异株提取的总RNA为模板，用设计的引物进行RT-PCR 扩增，检测到长度为327 bp的DNA片段。

2.2 特异性试验

对PEDV经典毒株CV777、猪传染性胃肠炎(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)进行特异性检测，仅PEDV变异株中可检测出长度为327 bp的DNA片段，PEDV经典毒株及其他可能引起猪腹泻的病毒和健康猪材料中均未检测出(图1)。

2.3 敏感性试验

将提取的阳性RNA以10倍系列稀释，反转录后进行PCR，结果(图2)表明，RT-PCR最低可检测出10-3ng/μL的PEDV样品。

2.4 重复性试验

PEDV 变异株的6次PCR扩增的条带大小均约 330 bp，表明该方法具有良好的重复性。

2.5 临床样品检测

对我国华东地区采集的318份临床腹泻发病猪的样品进行RT-PCR检测，其中PEDV变异株阳性共有109份，阳性率为34.3%。结果表明，近年华东地区猪腹泻病发病中，PEDV变异株的感染率较高，应当引起足够重视。

2.6 RT-PCR方法的可靠性检测

将临床上检测的PEDV变异株阳性10份PCR产物进行克隆、测序，经过序列测定后发现所测序列与PEDV变异株AH2012株的同源性在99.5%以上，证实所建立的RT-PCR方法确实能够检测PEDV变异毒株。

3 讨论

PEDV属冠状病毒，主要破坏小肠茸毛，从而减小营养吸收的面积，并导致体液流失，引起脱水[1-2]。正常情况下，易感猪群遭病毒侵入2～3周内即可产生很强的免疫，病毒就会从猪群消失[1-2]。易感猪群初次接触病原时会爆发急性腹泻，这种情况下各种猪群的发病率可达100%，有的表现为轻微的腹泻，有的则呈现水样下痢，哺乳仔猪尤为严重。在规模化猪场当中，母猪群会存在反复性的感染，而没有母源抗体保护的仔猪会出现散发的临床症状。母猪具体表现为腹泻，可能有较微的牛粪样稀粪，也可能呈水样下痢；仔猪主要表现为腹泻、脱水，死亡率可能会很高，尤其是<10日龄的哺乳仔猪最为严重；断奶猪与生长猪主要症状为急性水样下痢，发病率可能很高，但死亡率通常较低[9]。

PEDV是目前临床上猪病毒性腹泻的主要病原[10]，而PEDV变异株是2010年我国爆发的大规模猪群腹泻疫情的主要毒株，其与PEDV经典毒株的同源性较高，且由于猪病毒性腹泻与猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis，TGE)在流行病学、临床症状、病理剖检等变化上非常相似，在快速诊断方面有一定的困难，尚需结合试验室诊断方法进行确诊。目前，主要的实验室诊断方法有免疫电镜法(IEM)、免疫荧光法(IF)、微量血清中和试验、ELISA法、RT-PCR法等[9，11]。而RT-PCR 方法是目前诊断PEDV 最敏感、特异的方法[9，11]。

本试验中，根据变异株AH2012等S基因发生缺失和插入的序列特征，设计合成引物。以样品总RNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.2的引物PEDV-VR进行反转录反应(RT)合成cDNA。以合成的cDNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1的引物PEDV-VF和核苷酸序列为SEQ ID NO.2的引物PEDV-VR进行PCR扩增，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定猪流行性腹泻病毒变异株的存在。该RT-PCR方法解决了目前其他PCR方法不能解决的问题，从而特异、敏感、省时、省力、低成本地检测出猪流行性腹泻病毒变异株。因此，该技术可对猪流行性腹泻病毒变异株的诊断和监测起到重要作用。本试验中使用该RT-PCR方法对华东地区318份临床腹泻发病猪病料进行检测，发现其中109份为PEDV变异株阳性，阳性率达34.3%，可见今年我国猪群腹泻发病的病因中，PEDV变异株的感染仍是值得关注的问题。

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