烟草悬浮细胞系的构建

孔 琼，袁盛勇，肖亚楠，杨文超，陈俊梅，蒋双番，史艳春，杨 升

(红河学院生命科学与技术学院，云南蒙自 661100)

烟草(NicotianatabacumL.)为茄科烟草属的一年生草本植物，已成为当前生物学研究最为深入的模式植物材料，尤其在植物分子生物学、基因组学等方面应用最为广泛。植物悬浮细胞因具有均一性好、条件易控制、培养周期短、重复性好等优点，已广泛应用于细胞学、发育生物学、遗传学等研究中[1]。因此，建立稳定且活性高的烟草悬浮细胞作为试验材料，是开展后期试验的重要保证之一。植物悬浮细胞的建立受很多因素的影响，其中愈伤组织的成功获得和单细胞形成是两个重要环节，同时激素种类及浓度、接种量、蔗糖浓度、转速等也是关键影响因素[2-3]。本研究以烟草的幼嫩茎髓为试验材料，进行愈伤组织诱导和继代培养，并进行悬浮细胞培养，分析不同营养条件和培养条件对细胞悬浮系培养的影响，从而建立烟草悬浮细胞系的培养方法。

1 材料与方法

1.1 材料

以烟草BY-2品种为试验材料，烟草种子由昆明学院杨红玉教师惠赠。

1.2 方法

1.2.1 愈伤组织诱导及继代培养 将烟草幼茎切成1 cm长段，用70%乙醇消毒30 s后，再转入5%次氯酸钠中消毒 7 min，无菌水漂洗4～5次后用无菌滤纸吸干水分，切取茎髓，转入9种愈伤组织诱导培养基中，基本配方为MS+30 mg/L 蔗糖+14 mg/L琼脂，具体激素配比见表1。于 26 ℃ 暗培养3周，观察并记录愈伤组织的生长状况，统计出愈率和鲜质量。计算公式：接种量=接种后瓶质量(g/皿)-接种前瓶质量(g/皿)；愈伤组织鲜质量=收获量(g/皿)-接种量(g/皿)；出愈率=(诱导出愈伤组织外植体数/接种的外植体总数)×100%。

综合比较9种培养基上愈伤组织的生长速度、出愈率、鲜质量、形状、分散性、颜色等指标，筛选出诱导愈伤组织生长的最佳配方，并将其配方作为愈伤组织继代和悬浮培养的配方。

1.2.2 悬浮细胞系的建立

1.2.2.1 不同接种量对悬浮细胞生长的影响 选取白色疏松的愈伤组织1、2、3、4 g分别接种于150 mL液体培养基(“1.2.1”节中的配方)中，于26 ℃、140 r/min摇床振荡暗培养8 d后测定细胞鲜质量，3次重复。

1.2.2.2 蔗糖浓度对悬浮细胞生长的影响 将“1.2.2.1”节中最佳接种量培养10 d后的20 mL悬浮细胞转接到含有10、20、30、40、50 g/L蔗糖的130 mL新鲜液体培养基(“1.2.1”节中的配方)中，3次重复，于26 ℃、140 r/min摇床振荡暗培养8 d后测定细胞鲜质量。

1.2.2.3 转速对悬浮细胞生长的影响 选用“1.2.2.1”节和“1.2.2.2”节筛选出的最佳接种量和蔗糖浓度，制成液体培养基，分别于100、110、120、130、140、150 r/min的恒温摇床上于26 ℃振荡暗培养8 d后测定细胞鲜质量，3次重复。

1.2.3 悬浮细胞生长曲线、活性变化及pH值变化 根据“1.2.2.1”节、“1.2.2.2”节和“1.2.2.3”节筛选出的最佳结果，将悬浮细胞于26 ℃振荡培养12 d，每隔2 d取样测定细胞鲜质量、pH值和细胞活性，确定其生长周期。

1.2.4 数值测定

1.2.4.1 细胞鲜质量 根据李建安等介绍的方法[4]，具体操作：取充分混匀悬浮细胞8 mL，注入预先称质量的10 mL离心管中，在3 500 r/min下离心10 min，吸去上清液，室温下敞口自然风干24 h后称质量，减去空管质量即为8 mL悬浮细胞的鲜质量。

1.2.4.2 细胞活性测定 按照孔琼等介绍的方法[5]进行。即将0.2 g细胞加入3 mL 0.6% TTC溶液(用50 mmol/L pH值 7.5 磷酸缓冲液配制，内含0.05% Tween-20)，26 ℃暗培养24 h，3 500 r/min离心10 min，细胞转入大试管中后加入95%乙醇5 mL，80 ℃水浴20 min，冷却后3 500 r/min离心 10 min，取上清液于485 nm进行比色。

2 结果与分析

2.1 烟草BY-2愈伤组织诱导

为了研究不同激素组合对烟草BY-2愈伤组织诱导的影响，分别对不同诱导培养基中愈伤组织的生长情况进行观察分析。结果显示，8种激素配比的培养基均可诱导烟草茎髓长出愈伤组织，但愈伤组织产生的数量和性状之间存在明显差异(表1)。其中配方1、2和3中茎髓培养第3天时，茎髓边缘开始膨胀变大；7 d时，切口两端开始愈伤化，边缘产生肉眼可见的乳白色颗粒状愈伤组织；21 d后，出现结构疏松、生长旺盛的白色愈伤组织。但配方3中的愈伤组织获得量和颜色质地显著高于配方1、2中的诱导结果，出愈率高达 93.3%。而配方4未明显获得愈伤组织。配方5和7中获得的愈伤组织生长缓慢，伴有褐化现象。配方6、8和9中的愈伤组织生长缓慢，质地致密。因此，在诱导烟草BY-2愈伤组织过程中，激素2，4-D和6-BA配合使用比NAA、2，4-D和6-BA混合使用更能有效地促进愈伤组织产生和生长，且配方3(MS+3.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA)为诱导烟草BY-2愈伤组织生长的最佳配方。

表1 不同植物激素组合对烟草BY-2愈伤组织的诱导情况

注：采用最小显著差数法(LSD)评价差异显著性，表中数值为“平均值±标准误”，不同小写字母表示在0.05水平差异显著。表2同。

2.2 悬浮细胞系构建

2.2.1 不同接种量对悬浮细胞生长的影响 初始接种量对悬浮细胞系的生长有着明显影响，细胞需要达到一定的起始密度才能进行生长，但浓度过大又需要消耗大量的养分。因此，选择适宜的接种量是悬浮细胞培养过程中一个重要的因素。不同接种量对烟草悬浮细胞生长量具有较大影响。由图1可见，在150 mL液体培养基中，当初始接种量为1、2 g时，烟草悬浮细胞生长速度较慢，显著低于3 g和4 g的初始接种量；初始接种量为3 g时，悬浮细胞生长速度快，第8天后，8 mL 细胞鲜质量高达(0.727 3±0.003 8)g。

2.2.2 蔗糖浓度对悬浮细胞生长的影响 碳源是植物组织培养中的必需营养因子，同时也参与了渗透压的平衡调节，因此起着十分重要的作用。蔗糖浓度对烟草悬浮细胞鲜质量增加的影响如图2所示。当蔗糖浓度为1%、2%时，烟草细胞增殖不明显且差异不显著；而蔗糖浓度为3%、4%、5%时，细胞增殖较快，且差异显著，尤其是浓度为3%时，细胞增殖最快，显著高于其他处理。

2.2.3 转速对悬浮细胞生长的影响 不同的转速对悬浮细胞的分散性、长势和贴壁现象具有较大的影响。在最佳接种量和蔗糖浓度下，转速对悬浮细胞生长也有不同的影响，过高或过低均不利于细胞生长。当转速为l10～120 r/min时，细胞生长缓慢，细胞鲜质量增加不明显，细胞分散性差，容易在短时间内形成较大的细胞团；转速为130～140 r/min时，细胞生长较快，分散性好，且140 r/min时细胞生长最快，培养8 d后8 mL细胞鲜质量高达(0.639 5±0.009 4)g，鲜质量高于其他处理；而当转速高达150 r/min时，细胞增长量有所下降，且易出现污染问题，贴壁死细胞较多(表2)。因此适宜烟草悬浮细胞培养的转速为140 r/min，有利于细胞生长。

2.2.4 烟草BY-2悬浮细胞系的生长曲线、pH值及活性变化 在优化后的培养条件下，测定了烟草悬浮细胞培养过程中细胞鲜质量和pH值变化，并绘制了其生长曲线。在培养过程中，细胞生长量近“S”形规律，鲜质量变化趋势明显，且与活性变化密切相关，而培养液中pH值呈下降趋势(图3和图4)。延迟期(1～2d)和对数期(3～10d)明显，且在对数期时，细胞增殖明显，当培养到10 d时，细胞鲜质量达到最大值。根据不同培养时间下细胞活性测定结果，发现细胞活性变化与生长量变化相似，且在培养8 d时达到最高值，活性最好。因此结合细胞生长量变化，烟草悬浮细胞的继代周期为8 d。

表2 转速对悬浮细胞鲜质量的影响

3 结论与讨论

在植物悬浮细胞培养过程中，激素是愈伤组织诱导和悬浮细胞构建的关键因素之一，不同激素种类和浓度配比后，其相互作用可影响其形态建成方向[4-6]。研究发现添加一定浓度的2，4-D和6-BA对愈伤组织诱导具有很大的促进作用，且2，4-D是禾谷类植物产生愈伤组织所必需的生长物质[7-8]。本研究在烟草愈伤组织诱导过程中也发现2，4-D和6-BA配比后的重要作用，且最佳诱导配比为3.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA。因此，合适的激素种类和浓度配比是愈伤组织获取和改善状态的重要前提。

初始接种量和蔗糖的多少对悬浮细胞系建立也起着重要作用。大多数悬浮细胞的生长具有群聚效应，细胞密度过低或过高都不利于悬浮细胞系的建立，而合适的密度才能促进细胞快速生长，细胞分散性好[9]。在小麦悬浮细胞系建立过程中发现，初始接种量为0.5～1.5 g(每400 mL培养液)时，细胞增殖倍数随着接种量的增加而增加，且接种量为1.5 g时达到最大值，此时细胞系分散性好，颜色鲜艳，如接种量增加，细胞增殖倍数呈下降趋势，培养液颜色浑浊[10]。同样的现象也在草莓悬浮细胞系建立试验中发现[11]。蔗糖浓度过低，培养物不仅得不到碳源补充，还会发生营养物质外渗，而过高则会出现生理性缺水，两种情况最终都会导致细胞死亡[12]。大量试验结果表明，一般悬浮细胞的培养过程中蔗糖浓度一般为20～30 g/L。因此，烟草悬浮细胞系构建的最佳初始接种量为3 g/150 mL，蔗糖浓度为30 g/L。

前人在研究烟草悬浮细胞系构建过程中发现，不同转速对细胞长势、分散性和贴壁现象具有较大影响[13]。同样的现象也表现于本试验中，当转速较低(110～120 r/min)时，悬浮培养基中的氧含量较低，细胞生长速度较慢，机械力较小，分散性较差，易结成团；而当转速较高(150 r/min)时，可能易发生机械损伤，死细胞较多。因此合适的转速也是悬浮细胞成功构建的关键因子。

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