上中下通用痛风汤对痛风性关节炎模型TLR4信号通路的影响

李 欣，柴晶美，杨阿龙，马怡轩，周丽雅

（长春中医药大学基础医学院，长春 130117）

痛风性关节炎（GA）属于代谢性骨关节疾病，是由于机体对嘌呤类物质代谢发生障碍，导致的血尿酸浓度过高，尿酸盐结晶沉积导致以关节炎症反应为主要表现的一种疾病[1-2]。上中下通用痛风汤是由金元四大家之一朱丹溪所创制，出自《丹溪心法·痛风》，上中下通用痛风汤具有宣畅气机、清热化痰、活血行瘀、通络止痛之功效。本课题组前期研究发现上中下通用痛风汤具有抗炎镇痛作用[3-5]，可降低关节肿胀程度，降低炎症因子表达，本研究将以TLR4/ NF-kB信号通路为切入点，分析上中下通用痛风汤抗炎镇痛机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级SD大鼠 60 只，雄性，体质量（200±20）g，由吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供，许可证号SYXK（吉）2013－0005。

1.2 药物与试剂 上中下通用痛风汤组方：酒炒黄柏、苍术、天南星各60 g，桂枝、威灵仙、羌活各9 g，防己l.5 g，桃仁、白芷各15 g，龙胆草1.5 g，川芎60 g，炒神曲30 g，红花4.5 g。按常规方法煎煮后浓缩至生药1 g/mL， 4 ℃冰箱冷藏备用。吲哚美辛片（上海信谊万象药业股份有限公司）；尿酸钠（美国 Sigma），SP试剂盒（北京中杉金桥生物科技有限公司），TLR4、MYD88抗体（美国BD）。奥林帕斯光学显微镜BX51。

1.3 动物分组、给药及造模 清洁级SD大鼠 60 只，雄性，体质量（200±20）g，随机均分为6 组：正常对照组，模型组，吲哚美辛组（5 mg/kg），上中下通用痛风汤高（20 g/kg）、中（10 g/kg）、低（5 g/kg）剂量组，正常对照组和模型组灌胃等量生理盐水，上中下通用痛风汤组灌胃给药，1 次/d，连续7 d，末 次 给 药1 h后，按Coderre[6]经典方法制备急性痛风性关节炎模型。空白对照组左踝关节注射等体积的生理盐水。

1.4 检测大鼠踝周径变化值 在受试踝关节相同部位于造模前及造模后6、12、24、48 h，用软尺测量受试踝关节周长，观察造模前后受试大鼠关节周长的变化。

1.5 滑膜组织形态学检测 取各组大鼠左踝关节，多聚甲醛溶液固定 24 h，脱钙 1 周；脱钙后进行常规脱水，石蜡包埋，经髁突矢状面以5 μm厚度低温连续切片，苏木精-伊红 （HE）染色，光学显微镜下观察上中下通用痛风汤对痛风性关节炎模型关节病理组织形态学变化。

1.6 滑膜组织TLR4、NF-κB检测 采用SP免疫组织化学法检测各组大鼠关节滑膜TLR、NF-κB蛋白表达情况。实验步骤按照说明书要求进行，染色结果为褐色的表示TLR4、MYD88阳性表达。 采用平均吸光度值反映TLR4、NF-κB阳性表达的强度，每例标本的被检区测 3张切片，采用 Image-Pro Plus 6.0 形态学图像分析系统进行分析。

1.7 统计学方法 数据采用统计软件 SPSS 19.0进行分析， 结果以均数±标准差（）表示， 两组间比较进行t 检验，多组均数间比较采用方差分析， 以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 上中下通用痛风汤对尿酸钠致大鼠踝周径的影响 与空白对照组比较，痛风性关节炎模型组大鼠造模后6、12、24、48 h不同时间点大鼠踝周径均显著增加（P＜0.05）。与模型组比较， 上中下通用痛风汤高剂量组大鼠在造模后随着时间延长大鼠踝周径均显著降低（P＜0.05）；上中下通用痛风汤中剂量组及吲哚美辛组大鼠在造模后大鼠踝周径也显著降低（P＜0.05），踝周径的动态变化见表1。中药中剂量组和吲哚美辛组相比无统计学意义，吲哚美辛组与中药高剂量组比较有统计学意义（P＜0.05），结果提示上中下通用痛风汤和吲哚美辛均能缓解大鼠关节肿胀，中药高剂量组优于吲哚美辛组。

表1 上中下通用痛风汤对大鼠踝周径的影响（，n = 10）

表1 上中下通用痛风汤对大鼠踝周径的影响（，n = 10）

注：与对照组比较，# P＜0.05；与模型组比较，△ P＜0.05；与吲哚美辛组比较，▲ P＜0.05

组 别踝周径变化6 h 12 h 24 h 48 h对照组 1.267±0.065 1.146±0.053 1.133±0.060 1.137±0.030模型组 1.739±0.369# 1.598±0.225# 1.475±0.390# 1.393±0.175#吲哚美辛组 1.545±0.136△ 1.497±0.128△ 1.407±0.146 1.206±0.180高剂量组 1.464±0.205△▲ 1.390±0.101△▲ 1.243±0.130△▲ 1.163±0.120△▲中剂量组 1.510±0.230△ 1.460±0.140△ 1.355±0.240△ 1.220±0.220△低剂量组 1.564±0.180△ 1.479±0.320△ 1.380±0.140△ 1.260±0.130△

2.2 各组大鼠踝关节滑膜组织病理观察 空白对照组 大鼠关节表面被覆透明软骨，关节囊腔光滑，结构层次清晰，未见滑膜肿胀、炎细胞浸润。模型组大鼠关节滑膜可见中度充血水肿、肿胀，伴有大量炎细胞浸润，滑膜细胞变性坏死，轻度增生。上中下通用痛风汤组可见关节滑膜较平整、轻度充血水肿。病理观察显示上中下通用痛风汤具有改善踝关节炎细胞浸润、滑膜组织破坏、血管扩张及充血功能。

2.3 上中下通用痛风汤对大鼠关节滑膜组织TLR4、NF-κB表达的影响 结果显示对照组大鼠踝关节滑膜组织中TLR4与NF-κB染色阳性区域较少，提示上中下通用痛风汤可降低痛风性关节炎模型大鼠关节滑膜TLR4与NF-κB蛋白表达。见表2。

表2 各组大鼠踝关节组织中TLR4、NF-κB表达的IOD/area值比较（，n = 10）

表2 各组大鼠踝关节组织中TLR4、NF-κB表达的IOD/area值比较（，n = 10）

注：与对照组比较，# P ＜ 0.05；与模型组比较，△P ＜ 0.05

组 别 TLR4 NF-κB对照组 0.235±0.004 0.31±0.035模型组 0.35±0.030# 0.45±0.120#吲哚美辛组 0.265±0.020△ 0.37±0.110△高剂量组 0.245±0.016△ 0.295±0.075△中剂量组 0.253±0.006△ 0.368±0.085△低剂量组 0.073±0.023△ 0.394±0.053△

3 讨论

痛风是属于机体嘌呤代谢紊乱所致的一类代谢性疾病，由于尿酸钠结晶在关节周围组织沉积而引起的急性炎症反应，其中炎症因子如IL-6、IL-1 、TNF-α、IL-8等参与痛风性关节炎的发生发展[7]。TLR4可识别作为机体内源性损伤相关分子模式的尿酸钠，启动其下游信号通路，诱导炎症因子合成并释放。有研究[8-13]发现，TLR4缺陷的小鼠关节炎的严重程度明显减轻。本课题组前期研究发现上中下通用痛风汤具有抗炎镇痛作用，可降低 IL-1、TNF、IL-6 等多种炎症因子的表达水平，对急性痛风性关节炎有较好的治疗效果。本研究以TLRs/NF-κB信号通路为切入点探讨上中下通用痛风汤抗炎镇痛作用，揭示其作用机制。

本实验研究发现，TLR4与NF-κB表达升高，伴有大鼠关节肿胀程度明显升高，而经上中下通用痛风汤治疗后，结果显示，TLR4与NF-κB表达下降，并伴有大鼠关节肿胀程度的降低，关节炎症显著改善，提示尿酸钠晶体可能通过被TLR4识别，并启动TLR4/NF-κB信号通路，进而加重急性痛风性关节炎大鼠关节组织的炎症反应。本实验结果提示，TLR4/NF-κB信号通路在急性痛风性关节炎发生发展中发挥重要作用，上中下通用痛风汤可通过调节TLR4/NF-κB信号通路发挥治疗作用，但其机理还有待进一步研究。

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