以正交设计法优选金连利耳口服液提取工艺参数

王丽鸣 于秀华

分泌性中耳炎目前被定义为“不伴有耳部急性感染症状和体征的中耳积液”，以耳痛、耳内闷胀感或堵塞感、听力减退及耳鸣为最常见症状[1]。小儿分泌性中耳炎发病率有逐年增高的趋势，也是儿童最常见的致聋原因，仅次于药物性聋。因此开发研究治疗此类病症的制剂有社会意义。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-2010A型高效液相色谱仪（日本岛津），SPD-10AVP检测器，C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Lambda25型紫外分光光度计（美国PE分析仪器厂），CP225D型双量程电子分析天平（德国 Sartoris），KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 药品

黄芩苷对照品（中国药品生物制品检定所）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 吸水率测定

称取原处方量的药材总重76 g，加入总量的4倍水，密封，每30 min测一次体积，3 h后吸水量不再增加，测得吸水量为128 ml，所以该处方吸水率为2倍。选择加水量为药材的4倍、6倍、8倍。

2.2 水煎提取工艺正交实验设计

对本处方的理化性质、化学成分的研究分析后，制订了该处方制剂中各药材的提取方法，黄芩苷为其主要活性物质之一，且该处方中的金银花、黄芩、连翘等主要有效成分水溶性均很良好[2]，所以以水为提取溶剂，采用煎煮法进行提取。按原处方比例称取金银花、黄芩、连翘等 9 份，每份试验药材总重76 g，黄芩精密称定，以加水量（A）、提取时间（B）和提取次数（C）为考察因素，采用三水平三因素L9（34）正交试验，以黄芩苷含量和干浸膏得率为评价指标，通过正交试验法对金连利耳口服液的提取工艺进行优选。因素水平表见表1，正交试验结果见表2。方差分析结果见表3。

2.3 黄芩苷含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适应性试验[3-4]色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：甲醇-水-磷酸 -（45∶55∶0.2）；检测波长：280 nm；柱温：室温。

应用预选的实验条件对供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液进行测定，其理论塔板数、分离度、保留时间、拖尾因子均符合要求，表明此色谱条件可行。

2.3.2 对照品溶液的制备 取黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇溶解制成0.1 mg/ml 的溶液，作为对照品溶液。

2.3.3 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液2.0、4.0、8.0、10.0、12.0、15.0、20.0 μl，注入液相色谱仪，测定，以峰面积积分值（Y）为纵坐标，以对照品（X）进样量为横坐标，绘制标准曲线及回归方程。

表1 金连利耳口服液水溶性成分提取工艺因素水平表

表2 水提L9（34）正交试验表

表3 黄芩苷含量方差分析结果

2.3.4 供试品溶液制备 取1～9号样品各适量，精密称定，精密加入70%乙醇30 ml，称重，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，称重，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3.5 样品测定 按照2.3.1条件测定样品。

2.3.6 统计方法 试验中全部的数据均应用SPSS 19.0统计软件进行分析处理。采用方差分析，P为双侧检验，P＜0.05为差异具有统计学意义；P＜0.01 为差异具有显著统计学意义。

2.4 水煎提取工艺结果

根据正交实验表及黄芩苷含量的方差分析表可知，提取次数（C）对处方中的黄芩苷含量影响最为显著，加水量（A）影响次之，提取时间（B）影响最小，优水平为C＞A＞B，且C3＞C2＞ C1，B3＞ B1＞ B2，A2＞ A3＞ A1优组合为 C3＞ A2＞ B3。所以该实验选择的组合为C3A2B2，即提取次数为3次，加水量为6倍，煎煮时间为1.5 h。

2.5 醇沉浓度的选择

取原处方量按照最佳加水煎煮，滤液浓缩至1.10～1.15（80℃），取等量三份，分别加乙醇使最终浓度为60%、70%、80%，放置（4℃）24 h，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，蒸干，减压真空干燥，测出膏率。测得的三者的出膏率分别为7.74%、7.37%、5.58%。

分别取水煎处理液3份，精密称定，分别加乙醇40 ml至乙醇最终浓度为60%、70%、80%，称重，超声处理30 min，放冷，称重，分别加60%、70%、80%浓度的乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，滤液置100 ml量瓶中，分别用少量60%、70%、80%浓度的乙醇分次洗涤所用容器和残渣，洗液滤入同一容量瓶中，分别加60%、70%、80%浓度的乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，即得。结果测得的黄芩苷的量分别为44.42 mg/g、39.78 mg/g、40.20 mg/g。

结果：以60%乙醇为提取溶剂所得样品出膏率最多，且黄芩苷含量最高，因此选用60%乙醇为最终溶液含醇量。

3 讨论

黄芩归肺、胆、脾、大肠、小肠经。通过现代的研究结果得知，黄芩当中是以黄酮类化合物为主要的活性成分，而且中黄芩苷的含量最高且其药理作用最为明显[5-7]。相关实验表明，黄芩总黄酮可以明显将小鼠强迫游泳以及悬尾实验所需花费的时间缩短，因此，其具有潜在的抗抑郁的效果[8]。

[1] 徐晓霞，周美萍，张小英. 疏风解毒胶囊治疗小儿急性非化脓性中耳炎临床观察[J]. 中华中医药杂志，2017，32（1）：368-370.

[2] 鲁寅生，梁艳. RP－HPLC法测定小儿柴桂退热颗粒中芍药苷和黄芩苷的含量[J]. 西北药学杂志，2017，32（5）：313-315.

[3] 张德静，牛小彩. 复方地黄合剂及复方逍遥合剂中黄芩苷含量测定[J]. 上海医药，2017，38（5）：66-69.

[4] 韦瑀龙，蓝晓庆，黄敏，等. 复方感冒颗粒特征图谱与黄芩苷含量测定方法研究[J]. 西部中医药，2017，30（3）：27-31.

[5] 李欣，魏朔南. 黄芩的生物学研究进展[J]. 中国野生植物资源，2006，25（6）： 11-15.

[6] 徐丹洋，陈佩东，张丽，等. 黄芩的化学成分研究[J]. 中国实验方剂学杂志，2011，17（1）：78-80.

[7] 栗俞程，沈继朵，刘亚敏，等. 黄芩主要黄酮成分的抗抑郁活性筛选[J]. 中国实验方剂学杂志，2012，18（11）：166-169.

[8] 栗俞程，李寒冰，张宾. 黄芩总黄酮对小鼠的抗抑郁作用[J]. 中国实验方剂学杂志，2011，17（23）：168-170.