基于网络药理学的“水牛角-珍珠母”药对作用机制研究Δ

2018-03-01吴嘉瑞蔺梦娟刘鑫馗

中国医院用药评价与分析 2018年1期

吴嘉瑞，蔺梦娟，刘鑫馗

(北京中医药大学中药学院，北京 100102)

“水牛角-珍珠母”药对为清开灵注射液中的重要药物组合。水牛角为牛科动物水牛Bubalusbubalis的角，首载于《名医别录》：“疗时气寒热头痛”[1]。水牛角苦寒，入心肝血分，能清热凉血、泻火解毒定惊[2-3]。现代研究结果表明，水牛角具有良好的解热、镇静等功效。水牛角在中医临床用于治疗或辅助治疗热病头痛、高热神昏、发斑发疹、出血、小儿惊风及咽喉肿痛等症[1]。《中华人民共和国药典：一部》(2015年版)收载含水牛角或水牛角浓缩粉的中成药44种[4]，占所收载中药成方及单味制剂总量的11%，包含被誉为中医治疗高热症“温病三宝”的安宫牛黄丸、局方至宝散和紫雪(散)[5]。珍珠母为常用中药材，据《中华人民共和国药典：一部》(2015年版)记载，珍珠母源于蚌科动物三角帆蚌Hyriopsiscumingii、褶纹冠蚌Cristariaplicata或珍珠贝科动物马氏珍珠贝Pteriamartensii的贝壳[4，6]。珍珠母咸寒质重，入心、肝经，既清肝平肝，又镇惊安神，用于治疗头痛眩晕、烦躁失眠、肝热目赤和肝虚目昏[2-3]。“水牛角-珍珠母”药对中，珍珠母可佐助水牛角达清热、镇惊和安神之功[2-3]。现代药理学研究结果表明，珍珠母的主要药理作用包括镇静、抗氧化、抗急性肝损伤、中和胃酸、调节免疫功能、抑菌、降血糖、抗肿瘤、利尿、抑制离体肠壁及子宫收缩和降低缺血脑组织的单个细胞趋化蛋白含量等。珍珠母在临床上主要被用于治疗失眠、神经衰弱、精神分裂症、癫痫、眩晕症、顽固性头痛及抑郁症等精神系统疾病，还被用于治疗顽固性皮肤病、原发性高血压病、顽固性肝硬化腹水、慢性胃炎、胃溃疡及湿疹等[7]。以往对中药的作用机制研究多采用动物实验、细胞实验等方法对其某一作用机制进行研究，难以获得中药作用机制网络的整体面貌。近年来，网络药理学融合系统生物学、多向药理学、生物信息学和计算机科学等多学科的技术和内容，进行“疾病表型-基因-靶点-药物”等多层次网络的构建，探索药物与疾病间的关联性，指导新药研发，阐明药物作用机制，其整体性、系统性及复杂性的研究视角和研究方法，与中医药的特点不谋而合[8]。因此，本研究基于网络药理学方法，通过构建“水牛角-珍珠母”药对的“药物-成分-靶标-疾病”多层次生物网络，结合基因功能注释和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，开展清开灵注射液的作用机制研究。

1 资料与方法

1.1 药物分子信息的收集和活性分子的筛选

通过检索中药综合数据库(traditional Chinese medicine integrated database，TCMID)(http://www.megabionet.org/tcmid/search/)和参考相关文献[9-10]，获得水牛角、珍珠母的药物成分，通过检索PubChem Compound数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound)获得相应分子信息，包括分子名称、InChI Key、相对分子质量(molecular weight，WM)、辛醇-水分配系数(XLogP3)、氢键配位电子供体数目(Hdon)、氢键配位电子受体数目(Hacc)、可旋转键数目(RBN)、分子极性表面积(TPSA)、类药性(drug-likeness，DL)、血-脑脊液屏障(blood brain barrier，BBB)、半衰期(half life，HL，t1/2)和分子结构。

1.2 分子互作靶标和疾病信息的收集以及靶标相应基因的获取

通过检索TCMID数据库获得相应成分的靶标及靶标相应疾病。靶标相应基因通过Uniprot(http://www.uniprot.org/)获取，检索Uniprot中的UniprotKB数据库，检索式为“organism：‘homo sapiens’ AND reviewed：yes”。将检索结果以Excel格式导出，即获得UniprotKB/Swiss-Prot数据库中人类的相关靶蛋白及其对应基因的记录。利用Excel软件的“VLOOKUP”函数匹配所获得靶标对应的基因信息。非蛋白质的靶标或其他致病菌中的靶标，通过检索NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或者利用多种搜索引擎检索获得。

1.3 网络构建与网络分析

将“水牛角-珍珠母”药对的药物、成分、作用靶标和相关疾病导入Cytoscape 3.4.0(http://www.cytoscape.org/)软件构建其“药物-成分-靶标-疾病”网络，利用Cytoscape 3.4.0软件的NetworkAnalyzer工具计算网络拓扑参数，包括度值(Degree)、介数(betweenness centrality，BC)等[11-13]。在生物网络中，Degree指一个节点与其他节点相连的边的数目[14]；BC指网络所用的最短路径中经过当前节点的数目，反映节点在特定网络拓扑结构中所处位置的枢纽程度[15]。利用节点Degree及BC排序确定网络关键节点是目前网络分析的主要策略之一[14]。因此，本研究采用该网络分析方法，确定关键节点，探讨“水牛角-珍珠母”药对的主要作用靶标、主治疾病及其作用机制。

1.4 基因本体(gene ontology，GO)分类富集分析

GO是主要为了统一表征所有物种的基因及基因产物的性质而发起的生物信息学计划[16]。GO数据库(www.geneontology.org)旨在建立一套适用于所用物种的、对基因和蛋白质功能进行限定和描述的、并能随着研究不断深入而更新的语义词汇标准。GO有3个分类：(1)细胞组分(cellular component，CC)，指基因产物位于何种细胞器或基因产物组中(如糙面内质网、核或核糖体和蛋白酶体等)，表明基因产物在什么地方起作用；(2)分子功能(molecular function，MF)，描述基因产物在分子生物学上的活性，如催化活性或结合活性；(3)生物学过程(biological process，BP)，指由分子功能有序组成的，具有多个步骤的一个过程。GO的结构是个有向无环图，每个语义多在自己的类别中与其他语义相关联，有时会与其他类别的语义相关联；语义之间的关系为“is a”或“part of”。利用Cytoscape 3.4.0软件Apps中的BiNGO 3.0.3对“水牛角-珍珠母”药对对应的基因分别进行GO分类富集分析[17-18]。BiNGO Settings面板的参数设置如下：簇名分别命名为“DZ-MF”“DZ-BP”和“DZ-CC”；选择“Paste Genes from Text”，将基因名称复制粘贴到输入框中，每个基因单独占一行；输出内容和方式依次选择“Overrepresentation”“Visualization”和“Overrepresented categories after correction”，参照集合选择“Use whole annotation as reference set”，物种选择“Homo Sapiens”，以Cytoscape层次网络图形式输出该基因集合相较于人类基因组比例更高的GO分类注释；选择“Hypergeometric test”的统计方法和“Benjamini & Hochberg False Discovery Rate(FDR)correction”的P校正法，设置显著性水平为P<0.01；分别选择“GO_Molecular_Function”“GO_Cellular_Component”和“GO_Biological_Process”进行GO-MF、GO-CC、GO-BP的富集分析。

1.5 KEGG通路富集分析

利用DAVID 6.8数据库(the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，https://david.ncifcrf.gov/)进行通路富集分析[19]。在DAVID的基因列表通用管理面板中复制粘贴基因列表，选择基因名称对应的基因标示符“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，提交基因列表；为所提交的基因列表选择对应的物种“Homo Sapiens”，背景也选择“Homo Sapiens”，即以人类全基因组为背景基因和参照集合。选择分析工具“Functional Annotation Tool”，采用默认的阈值EASE=0.1 and Count=2(EASE Score的阈值指最大P，Count的阈值指与某一通路相关的基因数目的最小值，统计检验基于modified Fisher Exact法)，可获得通路富集结果，点击链接可以查看KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)中对应的通路图及其详情。

2 结果

2.1 化学成分分子信息分析

“水牛角-珍珠母”药对共筛选出6个药物成分，主要包括氨基酸类及无机物等。其中，4个(占66.7%)分子符合“Lipinski’s rule of five”；4个分子的TPSA<90 Å2，分别为天门冬氨酸(C0007)、胆固醇(C0037)、丙氨酸(C0083)和盐酸胍(C0112)，提示这4个分子可能具有一定的BBB穿透性。采用SPSS 20软件对“水牛角-珍珠母”药对5个药物分子(碳酸钙除外)的分子信息进行统计描述，结果显示，5个药物成分均值符合“Lipinski’s rule of five”，说明5个药物成分总体具有较好的DL，见表1。

表1 “水牛角-珍珠母”药对5个药物分子(碳酸钙除外)的分子信息统计结果 Tab 1 Statistical results of information of the 5 drug molecules(except for calcium carbonate)of “cornu bubali-concha margaritiferallsta” herb couple

2.2 “药物-成分-靶标-疾病”网络分析

“水牛角-珍珠母”药对的“药物-成分-靶标-疾病”网络见图1(节点大小、节点名称字号大小与Degree呈正相关，连线粗细与EdgeBetweenness呈正相关)，共包括1 368个节点(2个药物，6种成分，765个靶标，595种疾病)和1 528条边线。采用Degree和BC排序确定关键节点，并结合不同类型节点的具体Degree范围，选出网络中Degree≥10的成分节点、靶标节点和Degree≥5疾病节点，见表2。由图1、表2可见，在“水牛角-珍珠母”药对网络中，Degree≥10的成分为胆固醇、精氨酸、天冬氨酸、盐酸胍和碳酸钙，其中前三者的Degree远高于其他节点，分别为328、261和173；Degree≥10的标靶分别为前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin G/H synthase 2，COX-2)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、5-羟色胺2 A受体(5-hydroxytryptamine receptor 2 A，5-HT2 A)、β2肾上腺素能受体、内皮型一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase, endothelial，eNOS)、凝血酶原和β1肾上腺素能受体。其中，COX-2和PPARγ的Degree较高于其他靶标节点，分别为33和28；前者与肺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、前列腺癌、肾细胞癌、腹主动脉瘤和泌尿系统肿瘤等肿瘤，关节炎、骨关节炎和类风湿性关节炎等炎症性疾病，原发性痛经等疼痛性疾病及阿尔茨海默病等32种疾病相关；后者与糖尿病、胰岛素抵抗和肥胖等代谢性疾病，胰腺癌、肾细胞癌和睾丸癌等肿瘤疾病，动脉粥样硬化、缺血性心脏病等循环系统疾病及炎症性肠病等27种疾病相关。Degree≥5的疾病分别为精神分裂症、阿尔茨海默症和炎症。

图1 “水牛角-珍珠母”药对的“药物-成分-靶标-疾病”网络 Fig 1 “Drug-composition-target-disease” network of “cornu bubali-concha margaritiferallsta” herb couple

节点名称DegreeBCC0037胆固醇3280.6548C0096精氨酸2610.4573C0007天门冬氨酸1730.2950C0112盐酸胍420.0674C0051碳酸钙420.0821T0998COX-2330.0369T0922PPARγ280.0288T0430EGFR170.0177T1218TNF170.0266T00255-HT2A170.0196T0202β2肾上腺素能受体160.0142T0851eNOS150.0256T1024凝血酶原130.0167T0201β1肾上腺素能受体100.0072D0834精神分裂症70.0037D0175阿尔茨海默病60.0025D0574炎症50.0027

2.3 GO分类富集分析

通过BiNGO获得了“水牛角-珍珠母”药对的基因集合中729个基因的分子功能注释信息，728个基因的细胞组分注释信息，722个基因的生物学过程注释信息。进一步对以上基因注释信息进行分类富集分析：(1)GO-MF获得196条富集结果，其层次网络见图2(节点大小代表基因数量多少，颜色深浅代表P大小)；(2)GO-CC获得116条富集结果，其层次网络见图3(节点大小代表基因数量多少，颜色深浅代表P大小)；(3)GO-BP获得973条富集结果，其层次网络较过于复杂庞大，未在文中表示，仅列出其中P<0.01且基因数量百分比≥10.0%的前20条注释信息，见表3。在图2—3中，节点代表基因的功能注释，各节点之间既有隶属关系，也存在平行关系。GO分类富集分析的结果显示，“水牛角-珍珠母”药对的基因集合分别富集在脂质结合、蛋白结合、转运活性、底物特异性转运活性、跨膜转运活性、底物特异性跨膜转运活性、受体活性、跨膜受体活性、G-蛋白耦连受体活性、分子传感器活性、信号传导活性、催化活性、氧化还原酶活性和水解酶活性等分子功能方面，细胞碎片、膜碎片、细胞外间隙、细胞外区域、细胞膜、细胞质、内质网、细胞器膜、细胞内膜系统、膜必须组分和膜固有组分等细胞组分方面以及小分子代谢过程、化学刺激响应、生物质量调控、生物过程正调控、初级代谢过程、细胞代谢过程、多细胞生物过程、结构发育和信号通路等生物学过程方面。

图2 “水牛角-珍珠母”药对相应基因GO分子功能分类的层次网络 Fig 2 Hierarchical network of GO classified molecular function of “cornu bubali-concha margaritiferallsta” herb couple related genes

图3 “水牛角-珍珠母”药对相应基因GO细胞组分分类的层次网络 Fig 3 Hierarchical network of GO classified cellular compositions of “cornu bubali-concha margaritiferallsta” herb couple related genes

表4 “水牛角-珍珠母”药对相应基因KEGG通路富集分析(EASE<0.05，Count≥10，FDR<0.01) Tab 4 KEGG pathway enrichment analysis of “cornu bubali-concha margaritiferallsta” herb couple related genes(EASE<0.05，Count≥10 and FDR<0.01)

2.4 KEGG通路富集分析

利用DAVID数据库对“水牛角-珍珠母”药对的基因集合进行KEGG通路富集分析，阈值参数设置为EASE=0.05，Count=10，共获得57条富集结果，其中EASE<0.05，Count≥10，FDR<0.01的通路共16条，包括神经活性配体-受体相互作用，PPAR信号通路，谷氨酸能突触通路，钙离子信号通路，胆汁分泌通路，脂肪的消化与吸收通路，抗菌药物生物合成通路，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路，精氨酸生物合成通路，类固醇生物合成通路，丙酮酸盐代谢通路，代谢通路，碳代谢通路，氨基酸生物合成通路及精氨酸、脯氨酸代谢通路和1个疾病通路肌萎缩侧索硬化症通路，见表4。

3 讨论

网络药理学研究策略具有整体性、系统性的特点，这与中医药整体观与辨证论治的原则不谋而合[20]。已有诸多研究应用网络药理学方法进行中药潜在活性成分和作用靶点的预测及中药作用机制的阐述[21-24]。为了从系统层面研究“水牛角-珍珠母”药对多成分、多靶标和多途径相互配合发挥综合治疗效果的作用机制，本研究构建了“水牛角-珍珠母”药对的“药物-成分-靶标-疾病”网络，通过网络拓扑学分析，表明该网络具备部分无标度和小世界的网络特性，说明网络中存在关键节点。以节点Degree和BC排序，结果显示，化合物分子胆固醇、精氨酸及天冬氨酸，靶标COX-2、PPARγ和疾病精神分裂症、阿尔茨海默症及炎症可能为该网络的关键节点。COX是花生四烯酸代谢过程中调节前列腺素合成的限速酶，目前发现有COX-1、COX-2和COX-3等3种亚型，其中COX-2为诱导性酶，在大多数细胞中不表达或少量表达，仅当细胞受到促癌剂、生长因子及炎性因子等刺激时，其表达上调，参与炎症和肿瘤的形成和发展；COX-2抑制剂有预防和治疗多种肿瘤的作用[25]。PPAR为核受体家族的重要成员，PPARγ为其亚型之一，PPARγ的生物学功能复杂，包括参与脂肪及糖代谢、能量平衡，控制单核细胞分化成熟，诱导巨噬细胞凋亡，抑制炎症反应，诱导肿瘤细胞分化和凋亡，抑制肿瘤血管生成，抗肝纤维化，抗动脉粥样硬化，调节血脂，降血压，改善心功能、参与心室重构，促进神经细胞的分化与成熟、参与神经细胞凋亡等[26]。在相关疾病方面，早在20世纪80年代就有临床报道，水牛角可用于血热型精神分裂症的治疗[27]；水牛角有明显的抗炎作用，可用于炎症的治疗[28]。GO富集分析和KEGG通路富集分析结果表明，“水牛角-珍珠母”药对对应的基因功能多与代谢相关，尤其与氨基酸代谢密切相关。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，对“水牛角-珍珠母”药对的多成分、多靶点与多种疾病间复杂网状关系进行研究。研究结果初步验证了“水牛角-珍珠母”药对的基本药理学作用和相关机制，并为进一步深入探讨其作用机制奠定了良好的基础。

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