硅胶固相萃取-高效液相色谱法测定植物油中的特丁基对苯二酚含量

金瑚，熊巍林，包李林，周青燕，邹燕娣，林俞霞

(道道全粮油股份有限公司，国家油菜籽加工技术研发分中心，湖南 岳阳，414000)

食用油脂在加工、贮存、使用过程中极易受到光、热、酶、金属离子等作用而发生氧化酸败变质，尤其是富含不饱和双键的植物油更易发生氧化变质。为防止食用油脂酸败，产生对人体有害的物质， 生产厂家会其加入抗氧化剂。目前常用的氧化剂主要有丁基羟基茴香醚(butyl-hydroxyanisd，BHA)、二丁基羟基甲苯(butylated-hydroxytoluene，BHT)、特丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone，TBHQ)、没食子酸丙酯(propyl-gallate, PG)等，其中TBHQ的抗氧化性能是BHA、BHT、PG的2～5倍，且其热稳定性好，低毒，具有抑制细菌和霉毒作用，遇金属离子不着色等诸多优点而广泛应用在食用植物油中[1-3]。但是摄入过量TBHQ也会对人体造成伤害[4-5]，我国食品添加剂使用卫生标准(GB 2760—2014)规定TBHQ使用的最大量为200 mg/kg。因此油脂中TBHQ应该谨慎监测。现行检验方法主要采用气相色谱法[6-8]、薄层色谱法[6]、比色法[6]和高效液相色谱法[10-22]。油样的前处理大多采用溶剂提取法，而采用固相萃取的前处理较少。本实验采用硅胶作为吸附剂进行萃取，利用高效液相色谱进行测定TBHQ含量，为油脂中TBHQ含量的测定提供一种方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

硅胶(100～200 μm)，青岛海洋化工；TBHQ标准品(纯度≥99%)，滕州市天益工贸有限公司；甲醇(色谱纯)，Sigma-Alorich;正己烷(分析纯)，湖南汇虹试剂有限公司；二氯甲烷(分析纯)，天津市科密欧化学试剂有限公司；不含TBHQ的葵花籽油，公司自给；洗脱液为A:100 mL正己烷/二氯甲烷混合液(体积比1∶1),B：50 mL二氯甲烷。

1.1.2 仪器与设备

1260型高效液相色谱(配有紫外检测器)，安捷伦；RE-201型旋转蒸发仪，上海越众仪器设备有限公司；HGC-12A氮吹仪，天津市恒奥科技发展有限公司；玻璃层析柱d=1.2 cm，l=47 cm，带砂芯配旋塞,上海宸乔生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

色谱条件：ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm)；柱温为30 ℃；检测波长为280 nm；进样量20 μL；流动相C为甲醇，流动相D为1%乙酸水溶液，梯度见表1。

1.2.2 标准溶液的绘制和仪器检出限

称取0.1 g(精确至0.000 1 g)的TBHQ，用甲醇溶解并定量至100 mL，配制成1 mg/mL标样储备液。取一定量的标样储备液用甲醇分别稀释配制成10、50、100、150、200、250 μg/mL标准使用液， 按照1.2.1

表1 流动相洗脱梯度

中的液相色谱条件进行分析，以标准液的浓度为横坐标，其峰面积为纵坐标绘制标准曲线。其线性方程如式(1)所示，R2=0.998 6，以仪器的S/N=3计算，测得仪器最低检出限为1 mg/kg。

Y=20.84×C+34.6

(1)

式中：Y为峰面积；C为TBHQ质量浓度，μg/mL。

A值的大小决定了定子内圆单位表面积所产生的绕组铜损的大小，因而直接影响温升和效率的高低。在定子铁心内径确定的前提下，选择不同的槽数可决定不同的A值， 电机定子槽数与电负荷的对

1.2.3 样品的处理

向层析柱中湿法装入15.0 g硅胶，称取0.1 g(精确至0.000 1 g)油样，3～4 mL正己烷溶解上样，待流完后弃去，加入100 mL A或50 mL B洗脱液，流速为1滴/s，用平底烧瓶收集洗脱液，旋蒸浓缩至近干，向平底烧瓶中加入石油醚清洗2次，每次1 mL，将清洗液转移到 5 mL玻璃样品瓶中，并在60 ℃的氮吹仪蒸发至干，加甲醇定容至1 mL，过0.45 μm有机滤膜，上机测定。

2 结果与分析

2.1 样品前处理探讨

鉴于TBHQ和植物油的极性相差较大，而TBHQ属于酸性类物质，选用硅胶作为吸附剂，能满足两者的分离。能否准确测定油中的TBHQ含量，跟硅胶量、油样量、洗脱剂的极性和用量有密切关系。本实验以100 mg/kg葵花籽油为样品，以测出该样品的TBHQ含量和油脂净化率高为目的来优化前处理过程。

2.1.1 硅胶量的影响

固定100 mL洗脱液A或50 mL洗脱液B，油样为0.1 g(TBHQ为10 μg)，流速为1滴/s。分别称取10、15、20 g的硅胶进行试验，结果发现：当硅胶量为20 g时，使得少量的TBHQ残留在硅胶柱内没有被洗脱出来；当硅胶量为10 g时，样品组分在硅胶内未能进行有效的固液动态平衡分离，导致油脂没被吸附就洗脱下来了；当硅胶量为15 g时，TBHQ和油脂能较好地分离。

2.1.2 洗脱剂的选择

固定硅胶量为15 g，油样0.1 g(TBHQ为20 μg)，流速为1滴/s。鉴于目标物TBHQ属于较大的极性物质，因而选择洗脱剂为有一定极性的有机溶液。主要选择了挥发性较小，较为常见且挥发性较小，毒性较小的有机溶剂为正己烷和二氯甲烷。经过反复试验证明：直接选用极性较大的二氯甲烷作为洗脱剂，TBHQ较易洗脱下来，但是需要控制洗脱剂的用量，否则，用量太大油脂也会一同洗脱下来。经试验得知，单纯使用二氯甲烷作为洗脱剂，且用量为50 mL可以满足要求。当使用正己烷和二氯甲烷混合液时，需要配制合适的极性才能较好的分离TBHQ和油脂。经过反复试验，当正己烷和二氯甲烷的体积比为1∶1时，100 mL混合洗脱液足以将20 μg的TBHQ洗脱下来。

2.1.3 洗脱流速的影响

固定硅胶量为15 g，100 mL洗脱液A或50 mL洗脱液B，油样为0.1 g(TBHQ为10 μg)。流速过大，样品的洗脱时间缩短，但是吸附到硅胶上的组分还没来得及扩散就随着流动相洗脱出去了，使得分离效果差。流速过慢，使得分离时间也较长，组分在硅胶柱内的保留时间长，使得轴向扩散增大，不利于组分分离，经试验反复证明，流速为1滴/s可以较好地分离TBHQ和油脂。

2.1.4 油样量的影响

固定硅胶量为15 g，100 mL洗脱液A或50 mL洗脱液B，流速为1滴/s。油样量大，则更多油脂洗脱下来，油样量小，若样品的TBHQ含量少，则可能检测不出来。经试验证明，0.1 g的油样量较为合适。

2.1.5 层析柱规格的影响

固定硅胶量为15 g，100 mL洗脱液A或50 mL洗脱液B，油样为0.1 g(TBHQ为10 μg)，流速为1滴/s。分别选取内径分别为1.2 cm和2.0 cm的层析柱进行试验。试验证明：当层析柱内径为2 cm时，上同样量的硅胶，层析柱内填充硅胶高度较矮，使得TBHQ和油脂分离不理想；而当使用内径较小的层析柱时，硅胶高度较高，使分离效果较理想。

2.2 色谱分离条件

如图1所示，样品中的TBHQ与杂质能较好地分开，杂质峰不干扰测定。TBHQ的保留时间为6.227 min。将同一样品在同一天内重复测定6次并取平均值计算仪器的精密度，测得变异系数RSD%为5.5%，说明仪器精密度良好。

图1 样品中TBHQ的色谱分离图Fig.1 chromatographic separation figure of TBHQ in sample

2.3 方法的回收率和精密度

向不含TBHQ葵花籽油中添加TBHQ，配制浓度为500 mg/kg的储备样，继续稀释分别配制成60、100、250 mg/kg的标样，分别称取少于0.1 g(精确至0.000 1 g)的3种标样，作为3个加标水平，按照试验1.2.3样品处理过程，每个加标样水平进行3次平行测定，取平均值，计算3种方法的回收率和RSD%。测定结果见表2。

表2 TBHQ含量的回收率

由表2可知, 方法回收率在95.6%～103.7%， RSD%在3.5%～5.1%，说明该方法具有良好的准确性和重现性。

2.4 方法的最大萃取量

称取含TBHQ为250 mg/kg的油样0.1 g(精确至0.000 1 g)，按照1.2.3步骤处理油样。实验结果表明：100 mL的A洗脱液能洗脱21 μg TBHQ；50 mL的B洗脱液能洗脱16 μg TBHQ。

2.5 该方法测定结果与NY/T1602—2008农业行业标准的比较

由表3可知，该方法测出同一油样的TBHQ含量基本与农业行业标准一致。

表3 比对实验

2.6 样品测定

对本公司葵花籽油中的TBHQ含量进行抽检6批次，利用A洗脱液和B洗脱液分别抽检3批次，按照1.2.3的前处理过程进行处理，其结果如表4所示。

表4 样品中TBHQ含量

3 结论

采用硅胶作为吸附剂萃取植物油中TBHQ，利用反相液相色谱法测定其含量。本实验对硅胶的用量、油样量、洗脱剂的极性、流速和层析柱规格进行了优化组合。优化后的试验，其回收率在95.6%～103.7%， RSD%在3.5%～5.1%，同一样品的TBHQ含量测定结果与NY/T1602—2008测定的基本一致，说明该方法具有良好的准确性和重复性，可用于植物油中TBHQ含量的测定。

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