毕赤酵母Gpn12异戊烯基转移酶NovQ催化合成MK-3

吴锡华，李哲敏，刘会，王鹏，王丽，方雪，孙小雯，倪文枫，杨强，郑之明，赵根海

1 中国科学院合肥物质科学研究院 技术生物与农业工程研究所 强磁场与离子束物理生物学重点实验室，安徽 合肥 230031

2 中国科学技术大学 研究生院，安徽 合肥 230027

维生素K(Vitamin K，VK) 是一族含有共同化学结构2-甲基-1,4-萘醌环的物质统称。根据萘醌环3’位置连接侧链化学结构的不同又分为不同的类别。天然存在的维生素K包括K1(Phylloquinone，PK) 和 K2(Menaquinone，MK)，后又人工合成了K3等。在动物体内，维生素K1和维生素K3只有转化为维生素K2才具有生物活性[1-2]。图1显示了维生素 K1、K2及 K3的化学结构。维生素 K2依据侧链异戊烯单元个数n的不同[3-5]，可分为14种，通常以MK-n表示，例如，n为3时称之为MK-3。

图1 维生素K1、K2和K3 (从左到右) 的化学结构式Fig. 1 Chemical structures of vitamin K1, K2 and K3(from left to right).

维生素 K2传统生理功能主要体现在促进凝血酶原的产生和增加骨钙素的合成[6-7]。新近发现维生素 K2在降低肝硬化转化为肝癌的风险等方面，也有明显作用[8]。维生素K2可以采用化学合成法和微生物发酵法制备，化学法存在高能耗、高污染、副产物多和生物活性低等问题。而微生物法制备维生素K2条件温和、污染少、能耗低，产品本身来源于生物，具有高生物活性和高生物相容性。

目前报道生产维生素 K2的菌株主要有黄杆菌 (Flavobacteriumsp.，产MK-4)[9-12]和枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis natto，产MK-7)[13-17]。维生素K2在生物合成时，关键的萘醌母环异戊烯基化是由异戊烯基转移酶催化完成的。novQ基因来源于球状链霉菌Streptomycessp.和雪白链霉菌Streptomyces niveus，其产物NovQ是一种异戊烯基转移酶，主要参与合成新生霉素的环A结构。NovQ底物专一性不强，能催化多种萘醌、氢醌、酚类等化合物的异戊烯基化反应[18-19]。

巴斯德毕赤酵母作为一种成熟高效的基因工程蛋白表达系统，具有操作简单、培养方便、生长速度快、蛋白表达量高、成本低廉的优点[20-21]。作者实验室开展了采用毕赤酵母合成MK-3的研究工作[22]。以来源于雪白链霉菌的novQ基因利用pPIC9载体在GS115毕赤酵母中实现了异源表达和优化，并证实了其能使毕赤酵母合成维生素K2，主要是 MK-3；虽然使用的是分泌型载体，然而在实验中发现重组毕赤酵母Gpn12在胞内产MK-3具有较大潜力，本研究在此基础上确定重组毕赤酵母全细胞催化合成MK-3的关键因素，优化催化条件，为该菌的进一步扩大生产提供一定的借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

重组巴斯德毕赤酵母Pichia pastorisGpn12由本实验室保存[22]。

1.1.2 主要试剂

维生素K2(MK-4)标品购自Sigma公司；甲萘醌、异戊烯醇等为国产分析纯试剂；色谱级甲醇和二氯甲烷购自上海生工。蛋白提取缓冲液：NaCl 0.5 mol/L，氨基丁三醇0.2 mol/L，pH 7.4。无硫酸铵酵母无氨基酸氮源(YNB)10×母液：用蒸馏水配成3.4%溶液，0.22 μm滤膜过滤除菌后现用。生物素500×母液：蒸馏水配成 0.02%溶液，0.22 μm 滤膜过滤除菌备用。显影剂：0.1 mol/L Tis-HCl缓冲液(pH 8.5)，0.2 mmol/L对羟基苯丙烯酸，1.25 mmol/L 3-氨基苯二甲酰肼，需要时现加0.024%过氧化氢。

1.1.3 培养基

MGY培养基：甘油1%，硫酸铵 1%，YNB 0.34%，生物素0.000 04%；BMMY培养基：酵母粉 1%，YNB 0.34%，生物素 4×10–5%，蛋白胨 1%，0.1 mol/L磷酸钾缓冲液 (pH 6.0)，甲醇0.5%–3%，硫酸铵1%；MD固体培养基：YNB 0.34%，硫酸铵1%，生物素0.000 04%，葡萄糖2%，琼脂2%；BMY培养基：酵母粉1%，蛋白胨2%，0.1 mol/L磷酸钾缓冲液 (pH 8.0)，YNB 0.34%，硫酸铵1%，生物素0.000 04%；高密度发酵培养基：酵母粉1%，蛋白胨2%，甘油4%，0.1 mol/L磷酸钾缓冲液 (pH 8.0)，YNB 0.34%，硫酸铵1%，生物素0.000 04%。

1.1.4 主要仪器设备

G154TW 高压蒸汽灭菌锅，致微仪器有限公司；BSA124S万分天平，赛多利斯公司；数显PHS-25型pH计，上海雷磁仪器厂；J2-HS冷冻离心机，贝克曼库尔特公司；HZ200L恒温摇床，瑞华仪器设备有限公司；Essential LC-6高效液相色谱仪，岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 重组毕赤酵母Gpn12摇瓶培养

活化：28 ℃下在MD固体培养基上划线，静置培养至生长出明显菌落。挑取单菌落接种到含MGY培养基的三角瓶(25 mL/250 mL)中，28 ℃、200 r/min培养36 h。

诱导：按10%接种量，接种到含MGY培养基的三角瓶中，28 ℃、200 r/min培养36 h后，1 800 r/min离心5 min后，弃上清，用同体积BMMY重悬，同样条件培养至发酵结束。

1.2.2 甲醇诱导对重组毕赤酵母 Gpn12 NovQ 表达优化

前期探究了初始pH、诱导温度和诱导时间对表达优化的影响[25]。其对照组条件为 pH 6.0、28 ℃、72 h、3%甲醇，本文在此条件下，继续考察甲醇添加量(0.5%–3.0%)对NovQ表达的影响。并将最优甲醇添加量结果用于前期研究获得的优化后条件 (pH 8.0、25 ℃、96 h、3%甲醇)。NovQ蛋白半定量以NovQ表达最高的条件为100%，并设定为对照组。

1.2.3 30 L细胞催化剂制备

见前期研究文献[22]。

1.2.4 NovQ异戊烯基转移酶半定量

毕赤酵母采用冷冻研磨法破碎[23]：取酵母培养物5 mL离心去除上清，用生理盐水洗涤3次，加入3 mL蛋白提取缓冲液于–20 ℃预冻1 h后，转至预冻过的研钵中，加入3 g石英砂研磨10 min。

蛋白提取：转移酵母匀浆至25 mL离心管中，用2 mL蛋白缓冲液洗涤研钵，也并入离心管中。60 ℃水浴30 min，然后13 000 r/min离心5 min，上清转移到新离心管，加入 50 μL去氧胆酸溶液(2%)，混匀后，4 ℃放置30 min；加入500 μL饱和三氯乙酸溶液，混匀后，4 ℃静置6 h，13 000 r/min、4 ℃离心10 min，弃上清；沉淀加4 ℃丙酮5 mL重悬洗涤，13 000 r/min、4 ℃离心10 min，弃上清，重复3次；通风橱中吹干后，加入1 mL去离子水溶解，即得含NovQ异戊烯基转移酶的胞内蛋白。

蛋白检测半定量：使用蛋白印迹技术对 NovQ进行检测，Anti-6×his Tag鼠单抗为一抗，Goat Anti-Mouse IgG H&L为二抗。根据显色强度，对目标蛋白进行半定量。

1.2.5 重组毕赤酵母Gpn12全细胞催化合成MK-3条件单因素优化及响应面优化

全细胞催化对照组：发酵培养物10%装液量于250 mL三角瓶中，加入甲萘醌200 mg/L、异戊烯醇2 mL/L、甲醇2%、表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 0.5%，在pH 7.5、28 ℃、200 r/min条件下催化24 h，离心收集菌体，冷冻干燥后甲醇萃取，检测MK-3产量。考察单因素为：1) 初始 pH 4.5–8.5，梯度为 1；2) 催化温度 20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃；3) 催化时间 0、12、24、36、48 h；4) 甲醇添加量0、1%、2%、3%、4%；5) 甲萘醌添加量 0、50、100、200、300、400 mg/L；6) 异戊烯醇添加量0、0.5、1、2、3、4 mL/L；7) CTAB添加量0、0.2%、0.5%、0.8%、1.0%；其他条件同对照组。在单因素试验基础上，根据高点附近单因素方差分析选出具有显著影响的因素(P<0.05)进行Box-Behnken实验优化。

1.2.6 毕赤酵母30 L发酵罐催化合成MK-3

在 30 L 发酵罐中先后考察催化时间和细胞催化剂浓度对MK-3产量的影响。1) 催化时间：0、12、18、24、30、36、42、48、60、72、84 h；2) 细胞催化剂浓度：100、140、180、220、260 g/L。毕赤酵母培养方法同1.2.3。

1.2.7 MK-3检测方法

见前期研究文献[22]。

2 结果与分析

2.1 甲醇诱导条件对Gpn12表达NovQ的影响

诱导剂对诱导型转录表达有直接影响，甲醇是重组毕赤酵母Gpn12的诱导剂和诱导阶段的碳源。在前期实验对照组条件下，甲醇浓度对NovQ异戊烯基转移酶的表达影响如图2所示，NovQ表达量随着甲醇添加量的增加而增多，当甲醇添加量超过2%时，NovQ表达量反而降低，高浓度甲醇可能影响了毕赤酵母的生长代谢进而抑制NovQ的表达。图中3%甲醇添加量的条件与前期实验对照组条件完全相同。

基于前期实验优化条件，NovQ表达的差异如图3所示，甲醇浓度为2%时，NovQ表达量提高了36%左右。

图 2 甲醇诱导剂添加量对 NovQ异戊烯基转移酶表达的影响Fig. 2 Effect of methanol on the expression of NovQ prenyltransferase in shake flask fermentation.

图3 不同甲醇诱导条件下NovQ表达结果比较 (A：前期优化的NovQ表达；B：A基础上甲醇优化后的NovQ表达)Fig. 3 Comparison of NovQ expression results under different methanol-induced conditions. A: novQ expression of early optimization; B: novQ expression after methanol optimization based on A.

2.2 Gpn12全细胞催化合成MK-3条件优化

2.2.1 初始pH对MK-3产量影响

在活细胞催化实验中，pH同时影响着酶活性和细胞状态。初始pH对MK-3产量影响如图4所示，在pH 5.5–8.5范围，随着pH上升，MK-3产量增加；到pH 7.5时，MK-3达到高点，之后MK-3产量随pH上升反而降低。

2.2.2 催化温度对MK-3产量影响

温度是影响酶催化反应的重要因素之一。如图4所示，催化温度28 ℃以下时，MK-3产量随温度升高而降低，28 ℃时MK-3产量仅为75 mg/L左右。随着催化温度升高至32 ℃，MK-3产量达到88 mg/L左右，与20 ℃催化时MK-3产量大致相当。在BRENDA酶数据库中查到，NovQ异戊烯基转移酶(EC 2.5.1.111) 最适温度是30 ℃。结合实验结果，选定了与NovQ最适温度较为接近且MK-3产量较高的32 ℃作为下一步探索条件。

2.2.3 催化时间对MK-3产量影响

活细胞催化时间对 MK-3产量的影响如图 4所示，MK-3产量在催化进行12 h达到高点，之后无明显上升。时间过长时，细胞活力降低，合成速率低于分解速率，导致MK-3产量下降。36、48 h数据波动可能与液体蒸发有一定关系。

2.2.4 甲醇添加量对MK-3产量影响

如图5所示，甲醇添加量在2%以下时，MK-3产量呈微小上升趋势，而后随着甲醇添加量上升，MK-3产量略微下降。维生素 K2类化合物生物合成中异戊烯基焦磷酸合成需要能量，甲醇是催化过程中毕赤酵母的碳源和诱导剂，但其添加量对于MK-3产量的影响不明显。

图4 初始pH、催化温度和时间对MK-3产量的影响Fig. 4 Effect of initial pH, catalytic temperature and time on MK-3 production.

图5 甲醇、甲萘醌、异戊烯醇和CTAB对MK-3产量的影响Fig. 5 Effect of methanol, menadione, isopentenol and CTAB on MK-3 production.

2.2.5 甲萘醌对MK-3产量的影响

重组毕赤酵母 Gpn12通过芳香族异戊烯基转移酶NovQ催化萘醌环异戊烯基化。维生素K2类化合物前体甲萘醌对 MK-3产量的影响如图 5所示，MK-3产量随着甲萘醌添加量上升基本呈现上升趋势，当甲萘醌添加量达300 mg/L时达到高点，随后呈下降趋势。

2.2.6 异戊烯醇对MK-3产量的影响

Gpn12能自身通过复杂不明确的过程转化异戊烯醇合成寡聚异戊二烯[24]，作为MK-n(n<4)的R基侧链。异戊烯醇对MK-3的影响如图5所示，在其添加量达到3 mL/L时，MK-3产量达到高点。

2.2.7 CTAB对MK-3产量的影响

表面活性剂CTAB对MK-3产量影响如图5所示，随着CTAB添加量增加，MK-3产量上升，在CTAB达到0.8%后不再增加。可能原因是在CTAB达到临界胶束浓度之前，在水中呈单分子状态，不形成胶团，浓度上升可加大对细胞膜磷脂分子层的破坏，提高细胞膜的通透性，使前体进入细胞中，促进MK-3的合成；而随着浓度达到临界胶束浓度，继续增加浓度只会形成胶团，憎水基团隐藏在胶团内核，不具备继续增加细胞膜通透性的作用。

2.2.8 响应面优化

在单因素结果高点附近进行单因素方差分析，发现温度、甲萘醌添加量、催化时间具有显著影响(P<0.05)，对这3个显著因素继续进行响应面分析。表1所示为响应面设计实验因素水平和编码。

根据Design-Expert进行Box-Behnken设计，以MK-3产量为响应值，温度(A)、甲萘醌添加量(B)、催化时间(C)为自变量，进行三因素三水平实验。实验设计及结果如表2所示。

表1 响应面设计实验因素水平及编码Table 1 Experimental level and coding of response surface design

表2 响应面设计及MK-3产量Table 2 Response surface design and MK-3 production

得到回归方程为：

由表3方差分析结果可知，模型拟合程度极显著(P<0.001)，R2=0.987 8，表明模型与实际拟合良好；Adj-R2=97.22%，表明模型对MK-3产量变化可以很好解释；失拟不显著(P=0.767 8)，表明模型不需要添加项，与实验拟合较好。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

用 Design-Expert预测 MK-3在三因素–1到 1水平内最大值为96.475 mg/L。对应温度为31.6 ℃，甲萘醌添加量为295.59 mg/L，催化时间为15.87 h。三个平行实验验证 MK-3产量为 98.29、99.39、97.73 mg/L，平均产量为98.47 mg/L，与MK-3最大预估值相对误差为2.07%。

2.3 毕赤酵母30 L发酵罐催化结果分析

2.3.1 催化时间对MK-3产量的影响

毕赤酵母于发酵罐中培养诱导之后，在搅拌速率500 r/min、pH 7.5、温度31.6 ℃、甲醇2%、CTAB 0.8%、异戊烯醇3 mL/L、甲萘醌295.6 mg/L催化条件下，催化时间对MK-3的影响如图6所示。催化开始，MK-3含量迅速增加，在24 h达到高点，之后呈下降趋势。在相同时间内，发酵罐中产物积累快于摇瓶中积累，高点产量提高，时间延后。可能原因是在发酵罐中，pH、溶氧等条件维持稳定，细胞活力保持较长时间，利于MK-3合成。

2.3.2 细胞催化剂浓度对MK-3产量的影响

催化时间24 h、其他同2.3.1催化条件下，毕赤酵母细胞催化剂浓度对MK-3的影响如图6所示。随着细胞催化剂浓度升高，MK-3产量呈上升趋势，在细胞催化剂浓度 220 g/L时达到高点189.67 mg/L，随后不再继续升高。可能原因是细胞催化剂在一定范围内浓度升高有利于 MK-3的合成，但是浓度过高会使细胞生存环境恶化，不利于细胞活力的维持。

图6 催化时间和细胞催化剂浓度对发酵罐中MK-3产量的影响Fig. 6 Effect of catalytic time and cell catalyst concentration on MK-3 production in fermenter.

3 结论

重组毕赤酵母 Gpn12能异源表达异戊烯基转移酶基因novQ，并催化 MK-3的合成。在 NovQ表达上，本研究对甲醇添加量进行探究，发现在2%甲醇添加量时，NovQ表达比之前的研究提高了36%左右。在MK-3合成条件优化方面，在摇瓶中探究了催化时间、催化温度和甲醇添加量等 7个因素对 MK-3产量的影响，并对单因素方差分析筛选出的初始pH、催化温度和甲萘醌添加量3个因素进行了响应面优化，最终优化后条件为初始pH 7.5、催化温度31.6 ℃、甲醇添加量2%、甲萘醌295.59 mg/L、异戊烯醇3 mL/L、催化时间15.87 h和CTAB 0.8%，此时MK-3产量达到98.47 mg/L，比优化前提高了 35%；30 L发酵罐中催化合成MK-3，发现在细胞催化剂初始浓度220 g/L和催化时间24 h时，MK-3产量达到189.67 mg/L，比前期研究结果提高了1倍以上，表明高浓度细胞催化明显提高产量，有利于提高设备利用，提升生产强度。鉴于目前毕赤酵母表达和发酵的成熟工艺，本研究可显著推进异戊烯基转移酶 NovQ产业化生产及应用进程。

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