血管紧张素1-7对高脂诱导小鼠肝脏损伤的保护作用*

黄文瀚，任飞凤，罗 蕾，周 俊，潘珠玛，郭 晖，唐 琳△（.重庆医科大学附属第二医院风湿免疫科，重庆40000；.重庆市第七人民医院内分泌、肾病科400054；.重庆医科大学病毒性肝炎研究所，重庆40006）

高脂血症是导致肝脏疾病的独立危险因素[1-2]，脂质沉积与肝脏损伤密切相关[3-4]。人体对于低密度脂蛋白（LDL）的吸收主要受到低密度脂蛋白受体（LDLr）、固醇调节元件结合蛋白2（SREBP2）和SREBP分解活性蛋白（SCAP）的调控[5]，因此，三者组成负反馈系统，起到调节体内脂质的作用。

血管紧张素转化酶2（ACE2）-血管紧张素1-7[Ang-（1-7）]-Mas受体轴是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的一个新的分支，有大量研究报道了该轴参与脂质代谢的调节[6-7]，但是，其机制目前尚未明确。作者推测，Ang-（1-7）能够调节肝脏中LDLr-SREBP2-SREBP分解活性蛋白系统，进而减轻肝脏对脂质的吸收，起到保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康6周龄SPF级C57BL/6小鼠40只，购于重庆医科大学动物实验中心。

1.1.2 动物模型制备 将40只健康C57BL/6小鼠随机平均分为正常组、高脂组、高脂+Ang-（1-7）组、Ang-（1-7）组。正常组进食普通饲料；高脂组进食高脂饲料（热量组成：脂肪60%，蛋白质20%，碳水化合物20%）；高脂+Ang-（1-7）组小鼠在高脂饮食的基础上给予Ang-（1-7），以浓度144 μg/（kg·d）连续渗透泵（型号2002，Alzet）皮下泵入；Ang-（1-7）组小鼠在给予普通饲料饮食基础上，以同样Ang-（1-7）浓度连续皮下泵入。实验小鼠按上述实验方法饲养12周，环境温度控制在（20±2）℃，正常光照。

1.2 方法

1.2.1 采样方法 所有实验小鼠于采样前一晚20：00禁食不禁饮，12 h后采眼眶血，剖取肝脏。

1.2.2 检测方法

1.2.2.1 小鼠血脂水平检测 采集小鼠眼眶血后以2 000 r/min、离心15 min分离血清，并送检生化检测总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、LDL水平。

1.2.2.2 小鼠肝脏油红O染色 小鼠肝脏行冰冻切片后用10%甲醛盐溶液固定30 min，用双蒸水洗2次，向切片加1，2-丙二醇孵育2 min后，加油红O工作液对切片进行染色30 min，清洗后用Carazzi′s苏木素对切片染色2 min，清洗后使玻片充分干燥，用甘油乙烯醇（GVA）水溶性封片剂固定，在显微镜下对细胞进行观察并照相保存。

1.2.2.3 小鼠肝脏SREBP2蛋白测定 取小鼠肝脏按试剂盒说明提取总蛋白，并行蛋白浓度测定，等量取各组蛋白30 μg予以上样、电泳、转膜、封闭后，分别加SREBP2和磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）一抗孵育过夜，Tris碱吐温缓冲液冲洗后放入羊抗兔二抗中孵育1 h。洗膜后行电化学发光曝光采集图像，分析蛋白条带灰度值。

1.3 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，试验结果采用单因素方差分析（one-wayANOVA），多重检验校正采用Bonferroni校正。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠血清血脂水平检测结果 高脂组小鼠血清TC、TG、LDL水平均明显高于正常组和高脂+Ang-（1-7）组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；Ang-（1-7）组单独处理C57BL/6小鼠，其血清TC、TG、LDL水平与正常组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组小鼠血清血脂水平检测结果比较（±s，mmol/L）

表1 各组小鼠血清血脂水平检测结果比较（±s，mmol/L）

注：与高脂组比较，aP＜0.05

指标TC TG LDL正常组2.31±0.28a 0.44±0.04a 0.28±0.03a高脂组4.17±0.34 0.78±0.09 0.61±0.07高脂+Ang-（1-7）组3.11±0.21a 0.61±0.11a 0.47±0.05a Ang-（1-7）组2.26±0.32 0.47±0.06 0.31±0.05

2.2 小鼠肝脏组织油红O染色结果 正常组小鼠肝脏中脂质分布均匀（图1A）；而高脂组小鼠肝脏组织中可见大量红染脂质沉积（图1B）；Ang-（1-7）能显著抑制小鼠肝脏对脂质的吸收（图 1C）。Ang-（1-7）单独处理C57BL/6小鼠，其肝脏脂质分布与正常组无差异（图1D）。

图1 C57BL/6小鼠肝脏组织油红O染色（200×）

2.3 小鼠肝脏SREBP2蛋白表达水平 Western blotting检测结果显示，高脂组小鼠肝脏中SREBP2蛋白表达水平较正常组降低，高脂+Ang-（1-7）组小鼠肝脏中SREBP2蛋白表达水平较高脂组更为抑制，而Ang-（1-7）组小鼠肝脏中SREBP2蛋白表达水平与正常组无明显差异。见图2。

图2 C57BL/6小鼠肝脏SREBP2蛋白表达水平

3 讨 论

ACE2-Ang-（1-7）-Mas轴的发现使得该轴成为一项新的研究热点。SANTOS等[8]发现，在高脂诱导的大鼠模型中，Ang-（1-7）能够明显减轻大鼠的体重和皮下脂肪的含量，并且降低血浆TC和TG水平。此外，SINGH等[9]研究小组报道，在糖尿病大鼠研究模型中，Ang-（1-7）能够显著缓解大鼠血脂异常，进一步证实Ang-（1-7）对血脂的调节作用。

然而，ACE2-Ang-（1-7）-Mas轴的脂质调节机制仍然不清。OH 等[10]认为，Ang-（1-7）在大鼠体内通过增加甘油的释放起到分解脂肪的作用，而这一作用能够被磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制剂削弱，提示Ang-（1-7）是通过PI3K信号通路发挥作用。SANTOS等[11]则认为，脂肪脂质结合蛋白参与了脂肪酸的酯化过程，而Ang-（1-7）可增加体内该蛋白的表达，从而起到调节脂质代谢的作用。

本动物研究结果表明了另一种脂质调节过程，发现在高脂饲养的C57BL/6小鼠中，Ang-（1-7）能够显著降低小鼠血清TC、TG、LDL水平，抑制肝脏对脂质的吸收，并且证实ACE2-Ang-（1-7）-Mas轴参与脂质代谢调控是通过调节C57BL/6小鼠肝脏中LDLr-SREBP2-SCAP负反馈轴而实现。首先，本研究发现，高脂饮食可引起小鼠肝脏LDLr-SREBP2-SCAP轴正常的负反馈效应，使 SREBP2 蛋白的表达降低；其次，Ang-（1-7）在小鼠皮下微量泵入能够使这一负反馈效应放大，导致小鼠肝脏SREBP2蛋白表达进一步下降，而SREBP2的低表达可抑制LDLr基因转录，因此，LDLr的合成相应减少，从而阻止C57BL/6小鼠肝脏细胞对脂质的吸收，起到对肝脏的保护作用。

本研究进一步从机制层面阐明了ACE2-Ang-（1-7）-Mas轴对脂质代谢的调节，丰富了对Ang-（1-7）的认识，同时也为后续的研究打下了理论基础。

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