紫红红球菌9α–羟化酶loop对酶活性的影响

刘 扬，申雁冰，王九彬，王 敏

(工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

雄甾–4–烯–3，17–二酮(androst-4-ene-3，17-dione，AD)是合成甾体激素类药物的关键中间体，它的 9α羟基化产物9α–羟基雄甾–4–烯–3，17–二酮(9α-hydroxyandrost-4-ene-3，17-dione，9α-OH-AD)是生产9α位上有卤素的多种皮质激素的重要前体[1]. 能够进行 9α–羟化的微生物有很多，目前应用较多的菌种是红球菌(Rhodococcus sp.)和分枝杆菌(Mycobacterium sp.)．3–甾 酮 –9α–羟 化 酶 (3-ketosteroid-9α-hydroxylase，KSHAB)负责将 AD 转化生成 9α-OHAD，由末端加氧酶(KSHA)与铁硫还原酶(KSHB)双组分构成．

羟化酶的加氧酶组分 KSHA在底物进出酶活性中心出口处，存在一个 loop，像一个“开关”，将底物阻挡在活性中心通道外[2]．在本课题组前期对分枝杆菌转化植物甾醇生成AD的研究中发现，分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)TCCC11028的 3–甾酮–Δ1–脱氢酶靠近底物活性中心处的 loop上的 Ser138突变成性质不同的氨基酸 Leu138后，显著影响了该酶对 AD的活性[3]．已有文献证明柔性 loop的开关运动是调控酶催化作用的关键因素，比如磷酸丙糖异构酶与脂肪酶的晶体结构研究表明，柔性 loop 作为“开关”调节底物进入活性位点，进而影响酶对底物的活性[4–6]．

尽管目前有2个KSHA的蛋白晶体结构得到解析，但是KSHA的loop与酶活性之间的关系尚不清楚.本研究以已知晶体结构的紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)DSM43269的 KSHA5 loop为研究对象，应用定点突变技术探究loop对酶活性的影响，解析各氨基酸对 loop开关运动、调节底物通道的重要性，研究成果加深对 9α–羟化酶的认识有着重要意义，同时也为进一步研究其催化机理、改造酶蛋白活性提供理论依据．

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒与培养基

2.3.3 5-HT 3RA的应用情况 本研究中患者应用的 5-HT3RA 包括 Tro、Pal和 Ond。“指南”推荐 Tro 只在第1天静脉应用或口服5mg。有59例（53.15%）连续多日应用Tro，疗程过长。应用Pal存在的主要问题与Tro一致，有11例（9.91%）应用Pal疗程过长。有4例将Pal与Tro重复应用，因药物与受体的结合存在饱和现象，重复用药并不能增强疗效，反而会增大不良反应的发生率，两药重复应用为不合理用药。Ond应用主要存在超致吐级别应用、给药剂量偏小和疗程不合理。Ond为短效的5-HT3RA，应用Ond的例数较Pal和Tro少。见表6。

用限制性内切酶 NcoⅠ和 HindⅢ酶切质粒，鉴定重组质粒的正确性，如图2所示．

质粒 pGEM-T Easy购自 Promega公司，质粒pET-28a(＋)由本实验室保存．

LB 培养基(g/L)：蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，pH 7.5．固体培养基在此基础上添加2%,的琼脂粉．

1.1.2 试剂

黑龙江省龙江电器集团有限公司成立于1996年，为中小型企业，现有职工370人。龙江电器集团有限公司自2002年起开始推行企务公开工作。近年来，该公司以落实“三个代表”重要思想，贯彻党的依靠方针为指导，着力在规范、巩固、深化、创新、实效上下功夫。随着企务公开的不断开展，企业民主管理渠道不断拓宽，广大职工建功立业、奉献企业的热情不断高涨，该公司保持长周期安全稳定可持续发展。该公司先后荣获国家“五一劳动奖章”、省“厂务公开民主管理先进单位”、省、市“文明单位”等多项荣誉。

限制性内切酶(NcoⅠ、HindⅢ和 DpnⅠ)，NEB公司；蛋白质 Marker，北京全式金公司；TaKaRa LA TaqTMwith GC Buffer、DNA Marker，Takara 公司；KOD Plus，Toyobo公司；T4连接酶，Promega公司；质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒、基因组提取试剂盒，Omega公司；其他药品和试剂均为分析纯．

1.2 KSHA氨基酸比对与蛋白结构

KSHAB以NADH为辅酶，将来自NADH的电子最终传递到 O2，使底物被羟化．可以通过检测340,nm下 NADH被氧化时吸光度的变化表征KSHA5及其各突变体的活性，摩尔吸光系数 ε采用6.22,mmol/(L·cm)．酶活力单位定义为 1,min氧化1,nmol NADH所需要的酶量．KSH测定体系为含终浓度为 105,μmol/L的 NADH 和 250,μmol/L的底物AD(溶于 100%,异丙醇)的 200,μL 酶液．测定时，先向酶标板中加入198,μL蛋白酶液(质量浓度为 60,μg/mL)和 1,μL NADH 溶液(母液浓度为 21,mmol/L)，最后加入 1,μL 的底物(母液浓度为 50,mmol/L)，启动反应，在酶标仪上(33,℃)实时监测反应．

KSHA5无底物的3D结构(4QDF)与有底物AD的 3D结构(4QDC)从 Protein Data Bank数据库下载，用Discovery Studio 2.5软件分析有无底物存在时KSHA5的结构．

1.3 表达载体的构建

根据 KSHAB的末端加氧酶 kshA5与铁硫还原酶 kshB基因设计特异性引物，引入 NcoⅠ和 HindⅢ两个酶切位点，kshA5的上、下游引物分别为kshA5-TF1：5′-CCATGGTGTCCATCGACACCGCACGG-3′，kshA5-T-R1：5′-AAGCTT GGGGGTCGCGGTGGAGC C-3′；kshB 的上、下游引物分别为 kshB-T-F1：5′-CCATGGTGACAGCCGTCCAGGCACC-3′，kshB-TR1：5′-AAGCTT GAACTCGATGCGCACGTGGT-3′(其中标注下划线的碱基为添加的酶切位点)．

另外，通过不同类型的KSHA的比对，还发现在loop上存在两个非常保守的氨基酸，R217与 D219，用软件Discovery Studio 2.5分析了两者的相互作用，发现它们之间存在着盐桥相互作用，这可能起到固定loop位置的作用，使loop能更贴合到底物入口处．因此，将两者之一进行突变，把 R217变成 A217，使盐桥作用丧失，让loop比较松弛地靠近入口，使入口变大，考察其对活性的影响．

在4个组别温度升高的第1天、第3天和第10天，每个组别的每个重复中随机选择1只鸡，选择使用数字体温计测量肉鸡直肠温度。同时，在同一时间内，采集该重复的另1只鸡迅速使其安乐死，在3 min内取出下丘脑组织放入速冻管中-80 ℃保存，20 d内测定下丘脑中热休克蛋白70的浓度[2]。

1.4 loop上氨基酸的定点突变

以重组表达载体pET28-kshA5为模板，采用全质粒 PCR的方法进行突变子的构建，R217的上、下游突变引物分别为 TBR217A-F：5′-ACCGGTGCGGAGG ACGTCATCTCCG-3′，TBR217A-R：5′-GTCCTCCGCA CCGGTCGAGTGCAT-3′；T224的上、下游突变引物分别为 TBT224V-F：5′-TCCGGCGTGAACTACGACG ACCCCAAC-3′，TBT224V-R：5′-GTAGTTCACGCCGG AGATGACGTCC-3′；N225的上、下游突变引物分别为 TBN225L-F：5′-GGCACCCTGTACGACGACCCCA ACG-3′，TBN225L-R：5′-GTCGTACAGGGTGCCGGA GATGACG-3′；Y226的上、下游突变引物分别为TBY226F-F：5′-ACCAACTTTGACGACCCCAACGCC G-3′，TBY226F-R：5′-GTCGTCAAAGTTGGTGCCGGA GATGACG-3′；D227的上、下游突变引物分别为TBD227S-F：5′-AACTACAGCGACCCCAACGCCGAA C-3′，TBD227S-R：5′-GGGGTCGCTGTAGTTGGTGCC GGAGATG-3′；D228的上、下游突变引物分别为TBD228S-F：5′-TACGACAGCCCCAACGCCGAACTG C-3′，TBD228S-R：5′-GTTGGGGCTGTCGTAGTTGGT GCCGGAG-3′(其中斜体部分的碱基为突变位点)．PCR 反应体系(50,μL)：pET28-KSHA5 模板 1,μL，10×buffer for KOD plus 5,μL，dNTP mixture 6,μL，KOD plus 1,μL，25,mmol/L MgSO43,μL，10,μmol/L上、下游特异性引物各 2,μL，ddH2O 补齐至50,μL．反应条件：94,℃ 5,min；94,℃ 30,s，58,℃45,s，68,℃ 7,min，25 个循环；68,℃ 10,min．反应完毕后，直接向 PCR的反应体系中添加限制性内切酶DpnⅠ及其 buffer，37,℃消化模板 2,h，取 10,μL 消化液转化到 E．coli DH5α 感受态细胞中．挑取阳性克隆，测序正确后，转化E．coli BL21感受态细胞，得到各突变体的工程菌．

1.5 蛋白的诱导表达与纯化

挑取阳性克隆单菌落接种于 5,mL含 50,μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37,℃、200,r/min过夜培养．取培养液按体积比 1∶50转接于 50,mL含50,μg/mL 卡纳霉素的 LB 液体培养基中，37,℃、200,r/min培养，表达 KSHA5(或其突变体)蛋白的菌液培养至 A600＝0.4～0.6，表达 KSHB蛋白的菌液长至 A600＝0.2，加入 IPTG 至终浓度 0.5,mmol/L，30,℃、200,r/min 继续培养 24,h．

分别收集含KSHA5(或其突变体蛋白)与 KSHB的重组大肠杆菌菌体，加入破碎缓冲液(50,mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)，500,mmol/L NaCl，20,mmol/L 咪唑，0.1,mmol/L EDTA)彻底洗去培养基，再用破碎缓冲液重浮菌体，使各突变体细胞浓度保持一致．按体积比 1∶2取 KSHA5(或突变体)细胞悬浮液与KSHB细胞悬浮液，充分混匀，超声破碎细胞17,min(功率 32%,，工作 5,s，间隔 5,s)．蛋白纯化的过程参见文献[7]．纯化出的蛋白不需要透析(因为透析也会使蛋白的活性受到损失)，用 Bradford法定量总蛋白，并用软件 Quantity One分析确定 KSHA与KSHB含量的比值，通过添加纯 KSHB蛋白调整各突变蛋白与KSHB的含量比为4∶1．

1.6 蛋白活性测定

不同类型的KSHA蛋白的氨基酸序列用Clustal X比对．

2 结果与分析

2.1 蛋白分析与突变位点的选择

首先对 R．rhodochrous DSM43269的 5个不同类型KSHA的氨基酸进行了比对，结果如图1所示．

图1 KSHA5的氨基酸比对及结构Fig. 1 Alignment of amino acid of KSHA5 and its structure

从图 1(a)上可以看到，这 5种KSHA呈现高度相似，但loop区的氨基酸差别很大，α5螺旋、部分β折叠，以及二者之间的部分氨基酸也呈现很大差别，对照图1(b)和1(c)可以看到，α5螺旋和这部分β折叠的位置与 loop距离较近，这些位置的氨基酸都位于底物进出活性中心的通道处．每种 KSHA的 loop的氨基酸不同，对应的α5螺旋和这部分 β折叠的氨基酸就不同，推测它们之间可能存在协同变化的关系；而且，loop靠近底物入口处的氨基酸 T224–D228(图1(b)和1(c)中被椭圆形标中的loop区域)，在有无底物AD时变动非常明显，那么它可能参与到底物的运送过程进而调控酶活，因此，本研究将对loop的这部分区域进行定点突变，分别突变成性质不同的氨基酸 T224V、N225L、Y226F、D227S与D228S，探究这些氨基酸的作用．

2.2 穿刺结果 所有病例中，28例经穿刺活检病理结合特殊染色直接确诊（见图2），但其中2例仅提示真菌感染，未明确特异病原体，其余26例明确了感染病原体，诊断敏感度、特异度分别为：93.3%、86.7%，诊断时限为送检后1h至1周。确诊的肺真菌病分别为：肺隐球菌病19例，肺曲霉菌病4例，肺接合菌病（倾向毛霉菌病）2例，肺马尔尼菲蓝状菌病1例。2例未确诊，1例提示肉芽肿性炎，经氟康唑治疗有效，临床诊断肺隐球菌病，另1例外科术后病理证实肺毛霉菌。

提取 R．rhodochrous DSM43269基因组作为扩增模板，扩增羟化酶 kshAB基因序列．PCR 反应体系(50,μL)：基因组模板 1,μL，2×GC BufferⅠ25,μL，2.5,mmol/L dNTPs 8,μL，LA Taq DNA 聚合酶0.5,μL，10,μmol/L 上、下游特异性引物各 2,μL，ddH2O 补齐至 50,μL．反应条件：94,℃ 5,min；94,℃30,s，60,℃ 45,s，72,℃ 2,min，30 个循环；72,℃10,min．将PCR产物进行回收纯化，与pGEM-T Easy载体连接并送金唯智公司测序，测序正确后，经酶切、连接获得表达载体 pET28-kshA5与 pET28-kshB．胶回收纯化、酶切与连接等参照试剂说明书．

2.2 定点突变结果

紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)DSM43269购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、BL21(DE3)均由本实验室保存．

图2 重组质粒pET28-kshA5与pET28-kshB酶切电泳图Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of pET28-kshA5 and pET28-kshB treated with restriction endonuclease

突变位点和突变策略确定后，选用全质粒 PCR的方法进行基因突变，均扩增出大约7,000,bp的条带(图3)．经测序证明都突变成了相应的目的碱基．

两个泳道在1,000,bp以上位置出现的条带，分别与 kshA5和 kshB基因片段大小一致，证明重组质粒pET28-kshA5与pET28-kshB构建成功．

由于轨缝错台值主要通过第一个测点(间隙信号4)与其他3个测点比较计算得到，因此在悬浮架采集的4路间隙信号中取两端的间隙信号4进行分析。由图6的轨缝错台变化仿真图可知，间隙信号4基本反映了轨道错台情况，通过错台值能够准确表示高低突变。由于监测探头3、4之间有一定距离，因此错台值出现一段平台。

蚌埠市农田水利建设成效明显，为保障农业和农村经济发展发挥了重要基础作用。但农田水利建设基础仍然薄弱，建设滞后、标准偏低、管理粗放的问题不同程度存在，相对滞后的农田水利设施总体上依然是农村经济发展的制约因素，影响农业生产、农民切身利益、水资源节约和国家粮食安全。

图3 loop的定点突变Fig. 3 Site-directed mutagenesis of the loop

2.3 酶活分析

由于KSHAB酶是由加氧酶成分KSHA与还原酶成分KSHB同时存在才能发挥羟化酶KSHAB的活性，而且已有报道证明加氧酶组分KSHA以O2为最终电子受体，在空气中纯化 KSHA组分，会使KSHA组分失去活性，还原酶组分 KSHB，除了作为KSHAB酶催化体系的关键组分，同时还可以为KSHA的纯化提供还原性的环境，避免在有氧情况下KSHA 酶活性的丢失[7–8]．因此，本实验采用 A 组分与 B组分共纯化的方式进行蛋白纯化，蛋白纯化的结果如图4所示．

图4 蛋白纯化后的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱Fig. 4 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of the purified proteins

由图 4可知，所有蛋白均在相对分子质量 4×104以上位置处显示两条带，其大小与 KSHA、KSHB组分的大小一致，证明所有蛋白均纯化成功．用软件Quantity One分析所得各纯化蛋白的A组分与B组分含量的比例，使用Trace Tracking方法以及高斯建模模拟各条带的灰度值来确定A组分与B组分含量的比例．通过添加纯KSHB蛋白，使各纯化蛋白的A组分与 B组分含量的比例一致，测定酶活力的结果见表1．

表1 突变体的活性分析Tab. 1 Assessment of the activity of different mutants

loop经突变后的酶的活性较突变前的都有所降低，还有一些突变甚至给酶造成了完全失活的结果．将第217位的 R 变成 A后，活性降低为原来的35%,，碱性氨基酸变化成非极性氨基酸，丧失原来与第219位D之间的盐桥作用，使loop更加松弛地靠在活性中心处，导致 loop上靠近底物入口处的氨基酸与α5螺旋、β折叠等附近区域的相互作用减弱，推送底物进入活性中心的能力下降，可见，KSHA蛋白中该位置上的R高度保守是非常重要的．

T224侧链带有一个羟基，具有形成氢键的能力，从图 5(a)与 5(b)上看，在结构位置上，它更靠近α5螺旋．在底物进入活性通道时，T224有可能与α5螺旋上某个氨基酸作用，能较好地打开底物通道，顺利让底物通过，而其突变成 V后，极性发生较大改变.V是非极性氨基酸，容易埋在疏水性活性中心，不利于 loop打开通道，这可能是突变后监测不到酶活的原因．同样，第 225位 N变为 L后，活性也大大下降，Y226F也有明显下降．突变前两者的氨基酸具有形成氢键的能力，在蛋白质结构中是位于内外部皆可的氨基酸，而突变后的非极性氨基酸更倾向于伸入疏水性活性中心，不利于打开loop这个“盖子”，这也是 loop区该处位置在有无底物存在时发生很大变动的原因．没有底物时，它们可以靠近活性中心，起到保护活性中心的作用；当有底物存在时，这些氨基酸又向外运动，打开活性中心，在与周围区域的相互作用力下，给底物营造合适的环境，推送底物进入活性中心．D227(图5(c)与5(d))和D228从结构上看，有无底物存在时，虽然它们的位置变动较大，但它们的侧链更多地暴露在外面．D227和 D228是酸性氨基酸，可电离产生盐桥，与溶液中离子相互作用，可能起到支撑固定loop结构的作用，让T224–Y226能与其周围的氨基酸产生相互作用，调节底物通道；而突变成丝氨酸后，灵活性增强，丝氨酸可转动到活性中心处，也可暴露在外，削弱了对loop的固定作用．

图5 loop上靠近底物进入酶活性中心入口处的氨基酸Fig. 5 Amino acids of the loop near the entrance of the substrate entering the enzyme active center

3 讨 论

本文运用定点突变技术，确定了KSHA5的loop对酶活的重要性；loop上的氨基酸对稳定 loop运动结构和调节底物通道都有着不同的作用，尤其是靠近底物入口处的氨基酸，如 T224、N225和 Y226，它们与周围α5螺旋和β折叠存在一定相互作用，共同调节底物通道与底物运送能力；D227和D228起到支撑固定loop结构的作用．磷酸丙糖异构酶的loop上的A176就与其附近的β折叠上的Y208能产生相互作用，调节 loop的开关运动[4]．分枝杆菌(M．neoaurum)TCCC11028的3–甾酮–Δ1–脱氢酶靠近底物活性中心处的loop上的Ser138能形成氢键，在底物AD进入活性中心后，能用氢键固定住 loop，保持活性中心的疏水性；而突变成 Leu后，氢键作用丧失，从而导致活性中心暴露，最终影响了酶对底物的活性[3]．

在信息时代的大环境下，仍有许多施工单位的建设项目在管理项目档案时，采用传统的管理办法，在档案资料的收集和整理过程中，单纯依靠人工操作来进行管理，不仅加大了管理人员的工作量，工作效率也受到很大的影响。

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loop在蛋白质结构中的运动较为灵活，底物进出活性中心时 loop旋转摆动的动态过程，以及在这个运动过程中 loop上各氨基酸对底物的某种相互作用，还有底物进入活性中心过程中loop与α5螺旋和部分β折叠的相互作用，在目前的晶体结构信息中是无法获知的，仅用无底物或者底物在活性中心时这两个时刻解析的晶体结构，不能准确判断氨基酸的具体作用．而本研究运用定点突变技术揭示了 loop上氨基酸的具体作用，这将使后面的研究工作更加具有针对性．那么，在下一步工作中，我们会把工作重点放到loop的T224、N225和Y226这3个氨基酸上，并结合其附近的α5螺旋与β折叠，进行组合突变，研究三者对底物通道的调控，进而能提高酶的羟化活性．本研究成果有助于理解 9α–羟化酶及其催化机理，也为采用蛋白质工程改造 9α–羟化酶活性提供理论依据．

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