茶组植物种间关系的cpDNA、rDNA ITS和mtDNA序列分析

刘 振，赵 洋，杨培迪，成 杨，刘本英，李游勇，杨 阳*

(1.湖南省农业科学院茶叶研究所，国家茶树改良中心湖南分中心，湖南 长沙 410125；2.云南省农业科学院茶叶研究所，云南 勐海 666201)

【研究意义】茶[Camelliasinensis(L.) O.Kuntze]属于山茶属(Camellia)茶组(Sect.Thea)，为多年生常绿木本植物，起源于我国云南地区，我国拥有极其丰富的茶树资源。由于世代的异花授粉及人类的变异选择，使茶树种质资源的遗传背景复杂，变异体繁多，这给茶组植物“种”的划分带来了很大的困难[1-2]。随着分子生物技术的发展，DNA序列分析为植物鉴定、分类等研究提供了更为方便快捷的方法。DNA序列分析是区分个体间遗传差异的最直接方法，可提供基因组特异区的完全遗传信息[3]。植物DNA序列分析不仅是传统植物分类与鉴定的强有力补充，而且能使标本鉴定过程实现自动化和标准化，突破了对经验的过度依赖，并能够在较短时间内建成易于利用的应用系统，在物种系统进化、分类和鉴定等方面展示出了强大的生命力[4-5]。【前人研究进展】目前DNA序列分析已在中草药、苹果、水稻、香蕉等作物的系统进化、物种分类与鉴别等领域得到了广泛应用[3,6-9]，采用的DNA序列主要有cpDNA的rbcL、matK、trnH-psbA序列，rDNA的转录间隔区序列(ITS)和mtDNA序列等。研究表明，这些序列在不同物种间或同一物种的不同分类阶元上存在通用性和进化速率的差异，因此在进行序列分析之前，有必要对所选的序列进行评估，找到高效可行的引物序列。目前茶树上已有采用DNA序列进行亲缘关系研究的报道，陈春梅[10]采用3对叶绿体DNA序列进行了山茶属植物的亲缘关系研究，研究表明其中的2对表现出种内序列的高度保守性。由此可见，现有的DNA序列数量与质量还远不足以进行茶组植物的种间关系分析等研究。【本研究切入点】本研究对已报道的cpDNA、rDNA ITS和mtDNA中的不同序列在茶组植物的种内和种间进行了比较分析，探讨了序列分析在茶组植物研究中的可行性。【拟解决的关键问题】为茶组植物的系统演化和分类等研究提供了技术参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

参试16份茶树种质资源，其中原产于云南的7份采自于国家茶树种质资源云南茶树圃，其余资源均采自于湖南省茶叶研究所茶树种质资源圃，猪婆茶作为外类群。取1芽2叶新稍，液氮迅速冷冻处理，然后将其保存在-40 ℃冰箱中备用(表1)。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取 采用试剂盒(天根生化科技有限公司，型号DP305-02)进行DNA提取，提取方法参照试剂盒说明书。

1.2.2 引物合成 cpDNA和ITS序列引物参照高连明等[5]的引物序列，mtDNA序列引物参照邓长娟[6]引物序列，由天根生化科技有限公司进行引物合成。

1.2.3 PCR扩增体系 从表2可知，PCR扩增在Thermo-5020型PCR仪(Thermo Fisher Scientific. Int’l trade Co., Ltd.)上进行，扩增产物通过1.2 %琼脂糖凝胶电泳检测，PCR 产物送上海生工生物技术有限公司进行测序。

表1 16个参试茶树种质资源情况

表2 不同引物PCR反应程序

1.2.4 数据处理 使用dnastar软件(http://www.dnastar.com/)进行序列拼接，先剪去序列两端不可靠的碱基序列和引物序列，然后再将正反两个引物的序列进行比对，对序列进行编辑后获得正反引物序列一致的DNA序列。通过MEGA6.0软件中(http://www.megasoftware.net/mega)的 ClustalW 功能对所选材料的序列进行比对，适当手工校正，去除边缘不准确的部分序列，整理以待分析，计算碱基比例和变异碱基数[11]。采用MP法(most parsimonious tree, MP)构建分子系统树，对分支的可靠性评价使用靴带值(bootstrap，1000次重复)分析，自展数值75 %～100 %表示强支持率，50 %～74 %表示弱支持率，< 50 %表示不支持[3]。

2 结果与分析

2.1 引物通用性分析

本研究共合成引物15对(表3)，其中cpDNA序列引物共6对，ITS序列引物3对，mtDNA序列6对。研究表明：15对引物中有9对成功测序(图1)，3对扩增出2条目的片段(ITS5-ITS4、ITS5a-ITS4和ITS1-ITS4)，1对没有扩增出目的片段(cox2/2-3)，2对引物测序失败(trnH2-psbAF和nad4/3-4)。通用性最高为cpDNA序列引物，共5对引物成功扩增与测序，成功率为83.33 %；其次为mtDNA序列，共有4对成功扩增与测序，成功率为66.67 %；ITS序列区域引物的通用性较低，在茶组植物中均未扩增出单一目的片段。

2.2 不同序列特征差异

测序成功的9对引物中，有1对引物在所有资源间没有碱基差异(ccb256)，其余8对引物中，扩增序列长度最长的为390F-1326R(859bp)，最短的为orf25(446 bp)；GC含量最低为3F-IR(32.9 %)，最高为rbcla-rev(45.2 %)，cpDNA的GC含量平均值与mtDNA的基本一致(分别为40.06 %和41.87 %)；种间变异位点最多的为rbcla-rev(24个)，最少的为nad4L/orf25 (2个)，位点变异率最高的为rbcla-rev(4.76 %)，最低为nad4L/orf25(0.37 %)，cpDNA的碱基变异率平均值(2.91 %)要远高于mtDNA(0.55 %) (表4)。

2.3 不同序列引物的位点变异

本研究对C.sinensisvar.sinensis变种内和不同变种间的位点变异情况进行了人工统计(图2)，从表5可以看出，C.sinensisvar.sinensis变种内共发生变异的位点有9个，占总位点数的0.19 %；不同变种间发生变异的位点有90个，占总位点数的1.85 %。变异位点中除cox3引物序列外，其余序列的碱基颠换数都多于转换数，颠换数占变异碱基数的比例在50 %(cox3)到100 %(nad4L /orf25和orf25)之间。

图1 390F-1326R引物的原始峰图Fig.1 Direct sequencing peak map of primer 390F-1326R

DNA类型DNAtypes序列区域Region引物名称Primername引物序列Primersequence(5’⁃3’)扩增结果AmplificationresultcpDNArbcL1F⁃724RF：ATGTCACCACAAACAGAAACR：TCGCATGTACCTGCAGTAGC成功扩增rbcLa＿f⁃rbcLa＿revF：ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGCR：GTAAAATCAAGTCCACCRCG成功扩增rbcLa＿f⁃rbcL＿ajf634F：ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGCR：GAAACGGTCTCTCCAACGCAT成功扩增matK390F⁃1326RF：CGATCTATTCATTCAATATTTCR：TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT成功扩增3F⁃IRF：CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAGR：ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC成功扩增trnH⁃psbAtrnH2⁃psbAFF：GTTATGCATGAACGTAATGCTCR：CGCGCATGGTGGATTCACAATCC测序失败rDNAITSITS5⁃ITS4F：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGR：TCCTCCGCTTATTGATATGC无单一目的片段ITS5a⁃ITS4F：CCTTATCATTTAGAGGAAGGAGR：TCCTCCGCTTATTGATATGC无单一目的片段ITS1⁃ITS4F：TCCGTAGGTGAAGCTGCGGR：TCCTCCGCTTATTGATATGC无单一目的片段mtDNAccb256F：GGAAGTTAGCAAAGTTAGACR：TTGTTCTTAACAGCGATGGC成功扩增cox2/2⁃3F：TAGRAACAGCTTCTACGACGR：GRGTTTACTATGGTCAGTGC无目的片段cox3F：CCGTAGGAGGTGTGATGTR：CTCCCCACCAATAGATAGAC成功扩增nad4/3⁃4F：GGAGCTTTCCAAAGAAATAGR：GCCATGTTGCACTAAGTTAC测序失败nad4L/orf25F：CTGTYTTTTCGCACTTAGGCR：GTCCGRGGTACTATTGCTGT成功扩增orf25F：AAGACCRCCAAGCYYTCTCGR：TTGCTGCTATTCTATCTATT成功扩增

表4 DNA序列特征

2.4 参试材料的亲缘关系

按照表4从1至8的引物顺序将测序所得到的8条序列拼接，采用MEGA 6.0软件按照MP法构建分子系统树(图3)，可以将参试的16个茶树品种分为3大类，其中类群Ⅰ有8个品种，包括了除汝城白毛茶之外的所有栽培品种和地方群体品种单株，类群Ⅱ仅有一份资源，为黄泥河大茶，类群Ⅲ有7份茶树资源，包括了6个云南茶树资源和湖南的汝城白毛茶。类群Ⅰ的自展值达到了100 %，类群Ⅲ的自展值为68 %，外类群猪婆茶没有与其他品种完全分开。

图2 用MEGA 软件对齐后的部分1F-724R引物序列Fig.2 Partial sequences about 1F-724R using MEGA software

3 讨 论

3.1 不同序列引物在茶组植物中的通用性

本研究采用的15对引物序列均来自报道的文献，其中cpDNA序列引物共6对(5对成功扩增与测序)，ITS序列引物3对(均未获得单一目的片段)，mtDNA序列6对(4对成功扩增与测序)，通用性最高为cpDNA序列引物，这与高连明等研究结果相似[5]。同时， 利用ITS序列对山茶属植物进行系统发育分析时，发现山茶中存在ITS假基因，应用ITS假基因进行山茶属种水平的系统发育分析会对其真实的系统关系造成影响[12]，因此，在利用ITS序列进行山茶属植物系统分析时，首先应该对获得的序列进行真假判别。

3.2 不同序列引物在茶组植物中的位点变异

植物DNA序列由于在不同物种、不同分类阶元的系统发育研究中存在保守性的差异[13]，因此，针对某一特定的系统学问题选择相应合适的分子片段是序列分析中最为关键的一步。本研究中，3种不同区域的引物序列，cpDNA的碱基变异率平均值(2.91 %)要远高于mtDNA(0.55 %)，这与卢孟柱和Szmidt的研究结果相似[14]，说明线粒体基因序列的进化速率要低于叶绿体序列的非编码区核苷酸，因此，cpDNA的非编码区常被用于探讨种内或种间的亲缘关系[15]。在cpDNA的不同区域，matK序列区域的碱基变异率小于rbcL序列区域，matK序列两对引物的碱基变异率分别为0.70 %和1.10 %，小于于杰[9]对柑橘及其近缘属(2.36 %)、杨金宏与孔卫青[16]对马鞭草科部分植物(24 %)、王亚玲等[17]对木兰属植物(9.32 %)、仲轶[18]对野生鸢尾(5.39 %)的研究结果；rbcL序列的3对引物的碱基变异率分别为4.76 %、3.65 %和4.35 %，均高于于杰[9](2.56 %)和凡星等[19](2.91 %)的研究结果，而小于杨金宏与孔卫青等[16](10 %)、仲轶[18](12.54 %)的研究结果，这一方面可能是由于试验材料的物种及所处的分类阶元不同，另一方面，类群的样品数量和地理区域对研究结果也有较大的影响[20]，参试材料的分类阶元越高，参试样品的数量和代表区域越多，其碱基变异率越高。值得注意的是本研究trnH-psbA序列的trnH2-psbAF引物虽然测序结果存在重叠峰，正反向测序无法拼接，但是其序列中存在着较多的碱基变异率，这与陈春梅[10]采用trnL-trnF对山茶属 13 个种 98 份植物的研究结果相似(变异位点比率为17. 03 %)，说明trnH-psbA区域也是进行茶组植物序列研究关注的重点。

图中数字表示抽样检验的自展百分比Numbers in the figure indicate percentage of sampling inspection图3 基于8个序列和最大简约法(MP)构建的系统发育树 Fig.3 Phylogenetic tree constructed by maximum parsimony method with 8 sequences

引物名称Primername变异来源Variationsources变异位点Variablesites390F⁃1326R位点Sites195629650669702760变种间AmongspeciesG/CT/GA/GG/TG/TG/A茶变种内WithinC sinensisvar sinensisG/A3F⁃IR位点Sites2103161194213234668687700变种间AmongspeciesT/C无C/AC/AC/TA/CC/GC/TA/C茶变种内WithinC sinensisvar sinensisT/Crbcla⁃rev位点Sites32057166200239251254294324339364393403406415447448467480481483484486变种间AmongspeciesA/T缺/GA/GA/GA/GT/GG/CG/CT/GG/CA/GT/GA/TA/T无AGA/缺A/TT/CT/GT/GA/GA/GT/G茶变种内WithinC sinensisvar sinensisA/Grbcla⁃ajf634位点Sites14189262317347362387429438489506508533534535536537538539541542变种间AmongspeciesA/CA/GG/TG/TG/CG/AG/TA/GA/GT/CA/GG/TA/GA/C/G/缺C/G/TG/TT/GG/T/缺G/AC/TA/T茶变种内WithinC sinensisvar sinensis1F⁃724R位点Sites37146180219231234274304319344373383386395427447460461463464466变种间AmongspeciesA/GG/AG/AT/GG/CG/CT/GC/GA/GG/TT/AT/AG/AG/A缺/AT/CG/TG/TG/AG/AT/G茶变种内WithinC sinensisvar sinensisG/Acox3位点Sites24138474578变种间AmongspeciesA/GC/T茶变种内WithinC sinensisvar sinensisA/CG/TC/Tnad4L/orf25位点Sites143438变种间AmongspeciesC/AA/C茶变种内WithinC sinensisvar sinensisA/Corf25位点Sites120327变种间AmongspeciesA/CA/缺A/C茶变种内WithinC sinensisvar sinensisA/缺缺

3.3 序列分析在茶组植物亲缘关系分析中的可行性

DNA序列对物种进行识别和鉴定已成为生物学近期研究的热点之一[21]。本研究采用筛选8对DNA序列引物对参试的16份资源进行了亲缘关系分析，研究结果可以将参试资源分为3大类，除去汝城白毛茶之外的所有栽培品种和地方群体品种单株聚为了一类，自展值达到100 %，这可能是由于参试序列在茶组植物中的特点决定的，8对引物在茶变种内发生变异的位点仅占总位点数的0.21 %，有的序列甚至没有位点差异，茶变种内序列的高度保守性决定了同一变种聚在了一起。同时，部分引物在种间的变异率达4.76 %，说明所选的引物序列在茶组植物的茶变种内存在高度保守而在变种间存在一定的差异性，这也为序列分析在茶组植物中的应用提供了可能。但外类群猪婆茶没有单独分开，且云南各资源间的自展值都相对较小，说明筛选引物虽然在种间有一定的差异，但这些差异不足以完全将现有的资源区分开来，这与陈春梅等[10]研究结果相似。因此在进行茶组植物等较低阶元的分类研究时，还需要开发或筛选出具有较快进化速率的片段序列。

[1]陈 亮，虞富莲，杨亚军，等.茶树种质资源与遗传改良[M]. 北京: 中国农业科学技术出版社，2006.

[2]陈 亮，虞富莲，童启庆. 关于茶组植物分类与演化的讨论[J]. 茶叶科学，2000，20(2)：89-94.

[3]朱元娣，曹敏格，许 正，等. 基于ITS和matK序列探讨新疆野苹果与中国苹果的系统演化关系[J]. 园艺学报，2014，41(2)：227-239.

[4]Li D Z，Liu J Q，Chen Z D，et al. Plant DNA barcoding in China[J]. Journal of Systematics and Evolution，2011,49：165-168.

[5]高连明，刘 杰，蔡 杰，等. 关于植物DNA条形码研究技术规范[J]. 植物分类与资源学报，2012，34(6)：592-606.

[6]邓长娟. 香蕉种质资源种间线粒体DNA位点变异的遗传分类[M]. 海口：海南大学，2011.

[7]栗 丹，李振坚，毛 萍，等. 基于ITS序列石斛材料的鉴定及系统进化分析[J]. 园艺学报，2012，39(8)：1539-1550.

[8]刘铁燕，陈明生. 稻属植物的基因组进化[J]. 生物多样性，2014，22(1)：51-65.

[9]于 杰. 柑橘及其近缘属植物DNA条形码研制及其物种的鉴定研究[D]. 重庆：西南大学，2011.

[10]陈春梅. 基于cpDNA 序列的茶树及其近缘植物的亲缘关系研究[D]. 北京：中国农业科学院，2014：17-24.

[11]Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution，2013，30：2725-2729.

[12]尤 欢，周阿涛，岳亮亮，等. 山茶属植物 ITS的扩增及其序列特征分析[J]. 植物研究，2014，34(3)：403-408.

[13]刘 岩，程须珍，王丽侠，等. 基于叶绿体DNA序列的Ceratotropis亚属遗传进化研究[J]. 作物学报，2013，39(6)：979-991.

[14]卢孟柱，Szmidt A E. 松属线粒体基因变异研究[J]. 林业科学，1999，35(4)：14-20.

[15]Shaw J，Lickey E B，Schilling E E，et al.. Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms: the tortoise and the hare III[J]. American Journal of Botany，2007，94(3)：275-288.

[16]杨金宏，孔卫青. 基于rbcL和matK序列探讨马鞭草科部分植物的系统学位置[J]. 热带亚热带植物学报，2013，21(2)：116-122.

[17]王亚玲，李 勇，张寿洲，等. 用matK序列分析探讨木兰属植物的系统发育关系[J]. 植物分类学报，2006，44(2)：135-147.

[18]仲 轶. 基于多基因组的鸢尾属部分种的系统分类研究[D]. 哈尔滨：东北林业大学，2010：17.

[19]凡 星，罗小梅，罗春莲，等. 青藏高原仲彬草属植物叶绿体rbcL序列的谱系分析[J]. 四川农业大学学报，2010，2(3)：271-275.

[20]Dasmahapatra K K，Mallet J. DNA barcodes: recent successes and future prospects[J]. Heredity，2006，97(4)：254-255.

[21]闫化学，于 杰. DNA 条形码技术在植物中的研究现状[J]. 植物学报，2010，45(1)：102-108.